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Generazione di linee cellulari knockout CENP-E-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

Questo articolo riporta la costruzione di cellule knockout della proteina E associata al centromero (CENP-E) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e tre strategie di screening basate sul fenotipo. Abbiamo utilizzato la linea cellulare knockout CENP-E per stabilire un nuovo approccio per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori CENP-E, utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica.

Abstract

Il sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 è emerso come un potente strumento per l'editing genetico preciso ed efficiente in una varietà di organismi. La proteina-E ASSOCIATA AL CENTROMERO (CENP-E) è una chinesina diretta all'estremità positiva necessaria per la cattura del cinetocoro-microtubuli, l'allineamento cromosomico e il checkpoint dell'assemblaggio del fuso. Sebbene le funzioni cellulari delle proteine CENP-E siano state ben studiate, è stato difficile studiare le funzioni dirette delle proteine CENP-E utilizzando i protocolli tradizionali perché l'ablazione di CENP-E di solito porta all'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, all'arresto del ciclo cellulare e alla morte cellulare. In questo studio, abbiamo completamente eliminato il gene CENP-E nelle cellule HeLa umane e generato con successo le cellule CENP-E-/- HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9.

Sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, i fenotipi di allineamento cromosomico e le intensità fluorescenti delle proteine CENP-E, che migliorano efficacemente l'efficienza dello screening e il tasso di successo sperimentale delle cellule knockout CENP-E . È importante sottolineare che la delezione di CENP-E provoca il disallineamento cromosomico, la posizione anomala delle proteine serina/treonina chinasi B (BubR1) del checkpoint mitotico BUB1 e difetti mitotici. Inoltre, abbiamo utilizzato il modello di cellula HeLa knockout di CENP-E per sviluppare un metodo di identificazione per inibitori specifici di CENP-E.

In questo studio è stato stabilito un approccio utile per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori di CENP-E. Inoltre, questo articolo presenta i protocolli di editing genetico CENP-E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9, che potrebbe essere un potente strumento per studiare i meccanismi di CENP-E nella divisione cellulare. Inoltre, la linea cellulare knockout di CENP-E contribuirebbe alla scoperta e alla convalida degli inibitori di CENP-E, che hanno importanti implicazioni per lo sviluppo di farmaci antitumorali, studi sui meccanismi di divisione cellulare nella biologia cellulare e applicazioni cliniche.

Introduction

L'editing genomico ingegnerizzato media le modificazioni mirate dei geni in una varietà di cellule e organismi. Negli eucarioti, la mutagenesi sito-specifica può essere introdotta dall'applicazione di nucleasi sequenza-specifiche che stimolano la ricombinazione omologa del DNAbersaglio 1. Negli ultimi anni, diverse tecnologie di editing del genoma, tra cui le nucleasi a dita di zinco (ZFNs)2,3, le nucleasi effettrici simili all'attivatore di trascrizione (TALEN)4,5 e le meganucleasi homing 6,7, sono state progettate per scindere i genomi in siti specifici, ma questi approcci richiedono una complessa ingegneria proteica e procedure sperimentali ridondanti. Gli studi hanno dimostrato che il sistema CRISPR (Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) procariotico di tipo II è una tecnologia di editing genetico efficiente, che media specificamente la scissione del DNA guidata dall'RNA e sito-specifica in un'ampia varietà di cellule e specie 8,9,10,11. La tecnologia di knockout genico CRISPR/Cas9 ha rivoluzionato i campi della biologia di base, della biotecnologia e della medicina12.

I batteri e la maggior parte degli archaea hanno sviluppato un sistema immunitario adattativo basato sull'RNA che utilizza le proteine CRISPR e Cas per identificare e distruggere virus e plasmidi13. Streptococcus pyogenes L'endonucleasi Cas9 (SpCas9) contiene la risoluvasi della giunzione di Holliday simile a RuvC (RuvC) e il dominio His-Asn-His (HNH), che possono mediare in modo efficiente le rotture a doppio filamento (DSB) specifiche della sequenza fornendo un RNA sintetico a guida singola (sgRNA) contenente RNA CRISPR (crRNA) e crRNA transattivante (tracrRNA)14,15,16 . I DSB possono essere riparati attraverso la via di giunzione non omologa (NHEJ) o di riparazione diretta all'omologia (HDR), che introduce mutazioni multiple, tra cui inserzioni, delezioni o sostituzioni a singolo nucleotide senza cicatrici, nelle cellule di mammifero 1,8. Sia l'NHEJ soggetto a errori che la via HDR ad alta fedeltà possono essere utilizzati per mediare il knockout genico attraverso inserzioni o delezioni, che possono causare mutazioni frameshift e codoni di stop prematuri10.

La chinesina-7 CENP-E è necessaria per l'attacco del cinetocoro-microtubulo e l'allineamento cromosomico durante la divisione cellulare 17,18,19. La microiniezione di anticorpi20,21, la deplezione di siRNA22,23, l'inibizione chimica 24,25,26 e la delezione genetica 27,28,29 di CENP-E portano al disallineamento cromosomico, all'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso e ai difetti mitotici, che si traducono in aneuploidia e instabilità cromosomica 19,30. Nei topi, la delezione di CENP-E provoca uno sviluppo anomalo e la letalità embrionale nelle primissime fasi dello sviluppo 27,29,31. La delezione genetica di CENP-E di solito porta al disallineamento cromosomico e alla morte cellulare 26,27,29, che è un ostacolo nello studio delle funzioni e dei meccanismi delle proteine CENP-E.

Uno studio recente ha stabilito una linea cellulare knockout condizionale di CENP-E utilizzando un metodo di editing genetico CRISPR/Cas9 inducibile dall'auxina32, che consente una rapida degradazione delle proteine CENP-E in un tempo relativamente breve33. Tuttavia, ad oggi, non sono state stabilite linee cellulari knockout stabili per CENP-E, il che rappresenta una sfida tecnica irrisolta nella biologia del CENP-E. Considerando la robustezza genetica34, le risposte di compensazione genetica 35,36,37 e gli ambienti intracellulari complessi, poiché le conseguenze dirette della delezione completa di CENP-E possono essere complesse e imprevedibili, è importante stabilire linee cellulari knockout CENP-E per lo studio dei meccanismi di allineamento cromosomico, checkpoint dell'assemblaggio del fuso e vie di segnalazione a valle.

La scoperta e le applicazioni degli inibitori di CENP-E sono importanti per il trattamento del cancro. Ad oggi, sono stati trovati e sintetizzati sette tipi di inibitori di CENP-E, tra cui GSK923295 e i suoi derivati24,25, PF-277138,39, derivati dell'impalcatura imidazo[1,2-a]piridina40,41, composto-A42,43, sintelina44,45, UA6278446 e derivati benzo[d]pirrolo[2,1-b]tiazolo47. Tra questi inibitori, GSK923295 è un inibitore allosterico ed efficiente di CENP-E che si lega al dominio motorio di CENP-E e inibisce l'attività dell'ATPasi stimolata dai microtubuli di CENP-E con un Ki di 3,2 ± 0,2 nM24,25. Tuttavia, rispetto agli effetti inibitori della GSK923295 sulle cellule tumorali in coltura, gli effetti terapeutici della GSK923295 nei pazienti oncologici clinici non sono ideali48,49, il che ha anche sollevato preoccupazioni sulla specificità della GSK923295 per CENP-E. Inoltre, la specificità e gli effetti collaterali di altri inibitori di CENP-E sulle proteine CENP-E sono questioni chiave nella ricerca sul cancro.

In questo studio, abbiamo completamente eliminato il gene CENP-E nelle cellule HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. Sono state stabilite tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo, tra cui lo screening delle colonie cellulari, i fenotipi di allineamento cromosomico e le intensità fluorescenti delle proteine CENP-E, per migliorare l'efficienza dello screening e il tasso di successo dell'editing genetico CENP-E. Inoltre, le linee cellulari knockout di CENP-E possono essere utilizzate per testare la specificità dei composti candidati per CENP-E.

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Protocol

1. Costruzione dei vettori di knockout del gene CRISPR/Cas9

  1. Selezionare la sequenza di DNA genomico bersaglio sul gene umano CENP-E (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e progettare l'sgRNA utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR online (http://crispor.tefor.net/).
  2. Inserire una singola sequenza genomica, selezionare il genoma di "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs): dbSNP148", e selezionare il motivo adiacente al protospaziatore "20 bp-NGG-spCas9". Scegliere due sequenze guida, tra cui sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' e sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', in base ai punteggi di specificità50, all'efficienza prevista10 e agli off-target minimi.
  3. Ordinare e sintetizzare gli oligonucleotidi di DNA a singolo filamento (ssODN). Diluire gli ssODN in ddH2O fino a una concentrazione finale di 100 μM. Per fosforilare e ricuocere gli oligo sgRNA, aggiungere 1 μL di oligo diretto, 1 μL di oligo inverso, 0,5 μL di polinucleotide chinasi T4, 1 μL di tampone polinucleotide chinasico T4 e 6,5 μL di acqua priva di RNasi in una provetta di reazione a catena della polimerasi (PCR) e incubare la provetta a 37 °C per 30 min, 95 °C per 5 min; quindi, scendere a 25 °C a 5 °C min-1.
  4. Digerire il plasmide pX458 utilizzando l'enzima di restrizione BbsEquation 1 . Aggiungere 1 μg del plasmide pX458, 2 μL di tampone 10x G, 1 μL di BbsEquation 1 e aggiungere ddH2O privo di RNasi a 20 μL in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Incubare la provetta a 37 °C per 2 ore. Quindi, purificare il plasmide lineare utilizzando il kit di estrazione del gel di DNA della colonna secondo i protocolli del produttore.
  5. Legare gli oligo sgRNA nel plasmide pX458 (plasmide pSpCas9(BB)-2A-green fluorescent protein (GFP), Addgene ID. 48138). Aggiungere 1 μL di oligonucleotidi ricotti, 25 ng del plasmide lineare, 1 μL di tampone di legatura del DNA T4 10x, 0,5 μL di DNA ligasi T4 (350 U/μL) e portare a 10 μL con ddH2O in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Incubare la soluzione di legatura a 16 °C per 2 ore.
  6. Incubare 10 μL del plasmide costruito con le cellule DH5α competenti su ghiaccio per 30 minuti, shock termico a 42 °C per 45 secondi e posizionarle immediatamente su ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 500 μL di terreno Luria-Bertani (LB) e seminare le cellule su una piastra LB contenente ampicillina (100 μg/mL). Incubare a 37 °C per 16 ore e vagliare i cloni resistenti.
  7. Selezionare 5-10 colonie singole con un puntale per pipetta sterilizzato e trasferirle in una coltura da 1 mL di terreno LB con ampicillina (100 μg/mL). Incubare la coltura a 37 °C e agitarla a 180 rpm per 12-16 h.
  8. Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit di estrazione plasmidica secondo i protocolli del produttore. Validare il DNA plasmidico di ciascuna colonia mediante sequenziamento Sanger dal sito del promotore U6 utilizzando il primer U6-Fwd 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Estrarre e purificare i plasmidi utilizzando il kit di DNA plasmidico endo-free secondo i protocolli del produttore.

2. Trasfezione, isolamento e screening delle cellule HeLa knockout di CENP-E

  1. Colture di cellule HeLa in terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) integrate con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina in incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 .
  2. Incubare le cellule HeLa utilizzando acido tetraacetico (EDTA) allo 0,25% di tripsina/etilendiammina a 37 °C per 2-3 minuti, dissociare le cellule pipettando delicatamente, quindi seminare le cellule in nuove piastre con un rapporto di diluizione di 1:4 per il passaggio cellulare.
  3. Seminare le cellule in una piastra a 12 pozzetti e coltivare al 60-70% di confluenza prima della trasfezione. Trasfettare i plasmidi pX458-sgRNA in cellule HeLa utilizzando i reagenti di riferimento secondo i protocolli del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    1. Miscelare delicatamente 1 μg di plasmide pX458-sgRNA convalidato e 50 μL di terreno sierico ridotto nella provetta A. Quindi, mescolare delicatamente 2 μL del reagente di trasfezione e 50 μL di terreno sierico ridotto nella provetta B. Incubare separatamente le provette A e B a temperatura ambiente per 5 minuti.
    2. Mescolare delicatamente sia la provetta A che la provetta B e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere la miscela in una piastra da 12 pozzetti, incubare le cellule per 6 ore e sostituire il terreno con un terreno DMEM fresco.
  4. Esaminare le cellule HeLa dopo 24 o 48 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza per verificarne l'efficienza di trasfezione. Dopo la trasfezione per 48 ore, dissociare completamente le cellule HeLa trasfettate utilizzando tripsina/EDTA allo 0,25% a 37 °C per 3-5 minuti, contare il numero di cellule utilizzando una camera di Neubauer o un contatore di cellule automatizzato e piastre le cellule in tre piastre separate da 96 pozzetti per ciascuna popolazione trasfettata secondo i metodi di diluizione seriale10.
  5. Rimettere le cellule in un incubatore umidificato e poi coltivarle per altre 1-2 settimane. Cambiare il terreno di coltura una volta ogni 3 giorni. Per lo screening basato sul fenotipo e la convalida del knockout di CENP-E , dissociare ed espandere le cellule in piastre da 24 o 12 pozzetti per 5-7 giorni.
  6. Eseguire lo screening delle cellule mutanti con diametri di colonie cellulari più piccoli utilizzando un microscopio invertito dotato di obiettivi 10x e 20x.
    NOTA: Le mutazioni di CENP-E di solito provocano un aumento significativo del numero di cellule in divisione nelle colonie cellulari, che può essere uno degli indicatori chiave per lo screening delle cellule mutanti di CENP-E .
  7. Raccogliere le cellule per l'estrazione del DNA utilizzando il kit di estrazione del DNA genomico animale su colonna secondo i protocolli del produttore. Impostare le reazioni PCR come segue: 0,25 μL di Taq polimerasi, 5 μL di tampone 10x (Mg2+ plus), 4 μL di miscele di dNTP, 500 ng di DNA stampo, 1 μL di oligo diretto, 1 μL di oligo inverso e regolare ddH2O a 50 μL. Utilizzare le seguenti impostazioni del programma PCR per l'amplificazione genica: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s per 33 cicli; 72 °C, 10 min, quindi mantenere a 4 °C.
    NOTA: I primer specifici per la clonazione del locus bersaglio sono elencati come segue: CENP-E target F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; Obiettivo CENP-E R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; Bersaglio CENP-E F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; Obiettivo CENP-E R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Legare il DNA bersaglio nel vettore pMD18-T secondo i protocolli del produttore. Trasfettare il plasmide legato in cellule DH5α competenti e in coltura per la selezione dei cloni.
  9. Eseguire il sequenziamento Sanger per determinare i tipi di knockout CENP-E . Isolare il DNA plasmidico utilizzando un kit di estrazione plasmidica secondo i protocolli del produttore. Eseguire il sequenziamento Sanger del DNA plasmidico di ciascuna colonia utilizzando i primer M13 forward e reverse. Innesco M13F, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; Innesco M13R, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Seminare le cellule HeLa wild-type e mutanti CENP-E su vetrini coprioggetti da 12 mm in una piastra da 24 pozzetti, rispettivamente. Rimuovere il terreno DMEM completo e fissare le cellule in una soluzione fissativa salina tamponata con paraformaldeide/fosfato al 4% (PBS) a temperatura ambiente per 10 minuti.
  11. Colorare i nuclei con la soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) a temperatura ambiente per 5 minuti. Eseguire lo screening e convalidare le cellule mutanti CENP-E in base al fenotipo di allineamento cromosomico utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo Plan Fluor 40x/Apertura numerica (NA) 0,75.
  12. Eseguire lo screening e convalidare le cellule knockout di CENP-E utilizzando la colorazione e l'analisi in immunofluorescenza (vedere paragrafo 3) delle proteine CENP-E.

3. Colorazione in immunofluorescenza e microscopia confocale ad alta risoluzione

  1. Fissare le cellule con una soluzione fissativa di paraformaldeide/PBS al 4% a temperatura ambiente per 10 minuti e immergerle per 2 x 5 minuti in 1x PBS.
    NOTA: Assicurarsi che le cellule siano in buone condizioni e che le cellule siano raccolte e fissate delicatamente per evitare il distacco delle cellule in metafase.
  2. Permeabilizzare le cellule con Triton X-100/PBS allo 0,25% a temperatura ambiente per 10 minuti e immergerle in 1x PBS per 2 x 5 minuti.
  3. Bloccare le celle con l'1% di BSA/PBST (0,1% Tween 20 in PBS) a temperatura ambiente per 1 ora. Diluire gli anticorpi primari con BSA/PBST all'1% e incubare i campioni a 4 °C per 12 ore.
  4. Scartare le soluzioni di anticorpi primari, sciacquare le cellule 3 x 5 minuti con 1x PBS e incubare le cellule con anticorpi secondari diluiti a temperatura ambiente per 2 ore.
  5. Eliminare gli anticorpi secondari e sciacquare le cellule in 1x PBS per 3 x 5 min.
  6. Colorare i nuclei con DAPI a temperatura ambiente per 5 min. Montare le guide con il mezzo di montaggio. Sigillare i vetrini con lo smalto.
  7. Osservare e registrare le immagini di fluorescenza utilizzando un microscopio confocale a scansione dotato di un obiettivo 63x/NA 1.40.

4. Preparazione cromosomica e analisi del cariotipo

  1. Coltura delle cellule wild-type e CENP-E-/- HeLa in terreno DMEM completo integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina per 24 ore e quindi incubare le cellule wild-type e CENP-E-/- HeLa con colchicina 300 nM per 5 ore.
  2. Incubare le cellule con tripsina/EDTA allo 0,25% a 37 °C per 3 minuti e raccogliere le cellule in provette da centrifuga da 1,5 mL.
  3. Centrifugare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare i surnatanti, aggiungere 1,2 mL di soluzione KCl 0,075 mol/L e incubare a 37 °C per 20 minuti.
  4. Centrifugare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare i surnatanti, aggiungere 0,2 mL della soluzione fissativa (metanolo: acido acetico glaciale = 3:1) per la prefissazione e mescolare delicatamente per 1 minuto.
  5. Centrifugare le cellule a 1.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, raccogliere i pellet, aggiungere 1,5 mL della soluzione fissativa a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare a 1.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Scartare i surnatanti, aggiungere 0,6 mL di soluzioni fissative e preparare una sospensione cellulare. Aggiungere 3-5 gocce di sospensione cellulare da un'altezza di 35-40 cm sugli scivoli di ghiaccio.
    NOTA: Mantenere l'altezza per il rilascio delle sospensioni cellulari sui vetrini a 35-40 cm; in caso contrario, i cromosomi potrebbero essere troppo dispersi o non separati l'uno dall'altro.
  7. Asciugare immediatamente i vetrini con una lampada ad alcool, colorare i campioni con la soluzione colorante Giemsa al 10% per 7 minuti, sciacquare i vetrini con acqua corrente per 2 minuti e osservare i campioni utilizzando un microscopio ottico dotato di obiettivo Plan Fluor 40x/NA 0,75.

5. Saggio di formazione di colonie cellulari

  1. Preparare le sospensioni cellulari nelle piastre a 6 pozzetti con una densità cellulare di 1.000-2.000 cellule/pozzetto. Agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente le cellule.
  2. Mettere le piastre a 6 pozzetti in un incubatore di CO2 e incubare per 2-3 settimane a 37 °C con il 5% di CO2 . Cambiare il terreno di coltura una volta ogni 5 giorni. Registra le immagini utilizzando un microscopio invertito dotato di obiettivi 10x e 20x. Raccogli le cellule quando le colonie sono visibili (centinaia di cellule all'interno di un clone).
  3. Per studiare gli effetti della GSK923295, coltivare le cellule nelle piastre a 6 pozzetti per 24 ore e aggiungere 2 ml di GSK923295 alle concentrazioni finali di 10, 25, 50, 100 e 200 nM.
    NOTA: Non spostare la piastra di coltura nella fase iniziale della formazione del clone per evitare la perdita di cellule, che può formare nuovi cloni e influenzare lo screening delle cellule trasfettate.
  4. Scartare il terreno di coltura e fissare le cellule con PFA all'1% a temperatura ambiente per 10 minuti. Colorare le colonie con una soluzione colorante allo 0,1% di crystal violet a temperatura ambiente per 15 min. Risciacquare i campioni con 1x PBS tre volte. Registra le immagini delle colonie cellulari e quantifica i diametri di ciascuna colonia utilizzando il software ImageJ. Scegliete lo strumento di selezione Linea retta , fate clic su Analizza, scegliete Misura e registrate la lunghezza.
  5. Sciacquare le colonie con 1 mL di soluzione di acido acetico al 10% per 5 min. Trasferire 200 μL delle soluzioni surnatanti in una piastra a 96 pozzetti e misurare i valori di assorbanza utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre a A600 nm.

6. Saggio di vitalità cellulare

  1. Seminare le cellule nelle piastre a 24 pozzetti e coltivare le cellule per 48 ore all'80-90% di densità.
  2. Incubare le cellule con 100 μL di tripsina/EDTA allo 0,25% a 37 °C per 3 min.
  3. Miscelare 400 μL di PBS con le cellule con una pistola a pipetta. Trasferire 100 μL delle sospensioni cellulari nella piastra a 96 pozzetti.
  4. Aggiungere 20 μL di soluzione MTS in ciascun pozzetto con una concentrazione finale di 317 μg/mL e mescolare delicatamente secondo i protocolli del produttore. Incubare i campioni a 37 °C per 1-3 ore in un incubatore a CO2 .
  5. Registrare i valori di assorbanza di ciascun pozzetto al picco di assorbanza di A490 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. Utilizzare una lunghezza d'onda di riferimento di A630 nm per sottrarre il fondo fornito dai detriti cellulari e dall'assorbanza non specifica (Vitalità cellulare = A490 nm- A630 nm).

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Representative Results

Le cellule CENP-E-/- HeLa sono state generate con successo utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). La tempistica e le fasi sperimentali critiche di questo metodo sono mostrate nella Figura 1. In primo luogo, abbiamo progettato e sintetizzato gli sgRNA specifici per CENP-E, ricotto e legato gli sgRNA nel plasmide pX458, trasfettato il plasmide in cellule HeLa e coltivate per 48 ore. Le cellule trasfettate sono state dissociate e seminate in una piastra a 96 pozzetti utilizzando diluizioni seriali (Figura 1A). Le singole colonie sono state selezionate e sottoposte a screening utilizzando tre strategie basate sul fenotipo. I tipi di mutazione e le cellule knockout CENP-E sono stati convalidati utilizzando test di PCR, sequenziamento Sanger e immunofluorescenza (Figura 1A). L'esone 1 e l'esone 13 del gene CENP-E sono stati selezionati sul cromosoma 4 come siti bersaglio (Figura 1B). Il sistema CRISPR/Cas9 è in grado di indurre DSB prossimali alle sequenze del motivo adiacente al protospacer (PAM) utilizzando i domini endonucleasi RuvC e HHN, che attivano le vie NHEJ e provocano l'editing genetico: piccolo inserimento, delezione e sostituzione (Figura 1C). A causa di questi meccanismi di riparazione soggetti a errori, abbiamo ottenuto quattro popolazioni di cellule HeLa knockout del gene. L'efficienza di trasfezione di pX458-sgRNA è stata rilevata utilizzando un test di immunofluorescenza (Figura 1D). Abbiamo anche estratto il DNA genomico delle cellule HeLa di controllo, target 1 e target 2 (Figura 1E), amplificato il DNA del locus bersaglio e legato in pMD18-T per il sequenziamento del DNA e la convalida dei tipi di mutazione (Figura 1F). In sintesi, sono stati sottoposti a screening circa 100 cloni e sono state generate con successo quattro cellule HeLa knockout CENP-E stabili, tra cui l'inserimento di + 1 bp (posizione 28 nel clone 1 e nel clone 2), la delezione di -7 bp (posizione 1102-1108 nel clone 3) e una delezione di -1 bp (posizione 1102 bp nel clone 4) (sequenza codificante CENP-E, GenBank Adesione No. NM_001286734.2) (Figura 1G,H). Queste mutazioni hanno provocato mutazioni frameshift e arresti prematuri, che hanno portato alla completa delezione del gene CENP-E nel clone 1/2 e di due mutanti CENP-E nelle cellule Clone 3/4 HeLa.

Per migliorare l'efficienza e il successo sperimentale degli esperimenti knockout CENP-E, sono state sviluppate tre strategie di screening basate sul fenotipo. Questi si basavano sullo screening delle colonie cellulari mediante microscopia a contrasto di fase (Figura 2A), sull'allineamento cromosomico mediante colorazione DAPI (Figura 2B) e sulle intensità di fluorescenza delle proteine CENP-E utilizzando il test di immunofluorescenza (Figura 2C). Le fasi critiche del sistema CRISPR/Cas9 includevano il clonaggio dell'RNA guida, la trasfezione di pX458-sgRNA in linee cellulari, l'incubazione per 48 ore, la diluizione cellulare in una piastra a 96 pozzetti, la raccolta cellulare, lo screening e la convalida utilizzando tre strategie basate sul fenotipo (Figura 2D). La colorazione in immunofluorescenza dei gruppi di controllo e CENP-E-/-ha  mostrato che le intensità di fluorescenza delle proteine CENP-E sono state completamente eliminate nelle cellule CENP-E-/- Clone 1 e significativamente diminuite nelle cellule mutanti CENP-E Clone 3 (Figura 2E), il che dimostra ulteriormente l'efficacia del knockout genico mediato da CRISPR/Cas9 del CENP-E gene nelle cellule HeLa. I rapporti di cellule in metafase con disallineamento cromosomico sono aumentati da 0,30 ± 0,21% nel gruppo di controllo a 4,15 ± 0,57% nelle cellule HeLa clone 1 e a 5,85 ± 0,80% nelle cellule HeLa clone 3 (Figura 2F). Nel frattempo, i rapporti delle cellule in metafase sono aumentati da 3,49 ± 0,47% nel controllo a 5,86 ± 0,57% di cellule CENP-E-/- Clone 1 e a 6,70 ± 0,77% nelle cellule mutanti CENP-E Clone 3 (Figura 2G). Inoltre, il rapporto di cellule interfasiche è leggermente aumentato nei gruppi Clone 1 e Clone 3 dopo la delezione di CENP-E rispetto al gruppo di controllo (Figura 2H). Entrambi i tassi di cellule di profase, anafase e telofase sono leggermente diminuiti dopo la delezione di CENP-E, mentre i tassi di cellule in metafase sono aumentati dopo la delezione di CENP-E (Figura 2I). Per studiare ulteriormente i fenotipi di delezione di CENP-E, abbiamo eseguito la colorazione in immunofluorescenza di BubR1, una proteina chiave del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, e abbiamo scoperto che la localizzazione di BubR1 era anormale e l'accumulo di cinetocore di BubR1 era significativamente influenzato in assenza di CENP-E (Figura 2J-L).

Per comprendere meglio la crescita cellulare e la capacità di proliferazione delle cellule HeLa knockout di CENP-E, sono stati eseguiti saggi di formazione di colonie e colorazione in cristallo violetto per quattro cellule HeLa di CENP-E-/-, tra cui le cellule Clone 1, Clone 2, Clone 3 e Clone 4 (Figura 3A, B). La delezione di CENP-E provoca una ridotta capacità di formazione dei cloni, un diametro delle colonie più piccolo e una diminuzione del numero di cellule in ciascun clone (Figura 3A-D), il che suggerisce che CENP-E è essenziale per la formazione dei cloni e la proliferazione cellulare. Inoltre, abbiamo utilizzato il metodo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sale interno (MTS) e abbiamo eseguito saggi di vitalità cellulare e abbiamo scoperto che rispetto a 1,05 ± 0,00 nel gruppo di controllo, i valori di vitalità cellulare sono diminuiti a 0,66 ± 0,01 e 0,79 ± 0,00 nelle cellule CENP-E-/- HeLa (Figura 3E). Per indagare ulteriormente il ruolo di CENP-E nella stabilità cromosomica, abbiamo eseguito la preparazione cromosomica, la colorazione di Giemsa e l'analisi del cariotipo e abbiamo riscontrato una diminuzione del numero di cromosomi da 67,09 ± 0,50 nelle cellule HeLa wild-type a 56,08 ± 0,6 - 61,68 ± 0,83 nelle cellule CENP-E-/- HeLa (Figura 3F,G). Insieme, questi risultati indicano che la delezione di CENP-E inibisce significativamente la proliferazione cellulare, la formazione di colonie e la vitalità cellulare, il che suggerisce che CENP-E è essenziale per la crescita, la proliferazione e la stabilità cromosomica cellulare.

In questo studio, la linea cellulare knockout CENP-E è stata sviluppata come strumento prezioso per l'identificazione e la validazione di inibitori specifici per CENP-E. È stato stabilito un approccio utile per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori di CENP-E (Figura 4). Utilizzando GSK923295 24,25 come esempio, abbiamo trattato le cellule HeLa wild-type e le linee cellulari HeLa del clone 1 CENP-E-/- con una serie di concentrazioni di GSK923295 e abbiamo esplorato ulteriormente gli effetti degli inibitori di CENP-E su queste due cellule HeLa utilizzando i saggi di formazione delle colonie e i saggi di immunofluorescenza (Figura 4). Le singole cellule inoculate nelle piastre a 6 pozzetti sono state sottoposte a saggi di formazione delle colonie. Le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di GSK923295 e coltivate per 2-3 settimane e poi raccolte per ulteriori analisi (Figura 4A-D). Dopo la colorazione in cristallo violetto, i diametri delle colonie di cellule HeLa wild-type e cellule CENP-E-/- sono stati misurati utilizzando il software ImageJ. Nelle cellule HeLa wild-type, la formazione di colonie è diminuita significativamente dopo il trattamento delle crescenti concentrazioni di GSK923295. Inoltre, i diametri delle colonie sono diventati più piccoli dopo l'inibizione di CENP-E nelle cellule HeLa wild-type (Figura 4B-D). In particolare, le cellule CENP-E knockout Clone 1 HeLa non hanno mostrato alcuna diminuzione significativa dei diametri dei cloni in presenza di diverse concentrazioni di GSK923295, il che suggerisce che GSK923295 è un inibitore specifico senza effetti off-target significativi e senza evidenti effetti collaterali tossici nell'intervallo di concentrazione compreso tra 10 nM e 10 μM.

Successivamente, il fenotipo di allineamento cromosomico nelle cellule HeLa wild-type e nelle cellule CENP-E-/- è stato esaminato utilizzando il test di immunofluorescenza (Figura 4E). L'analisi quantitativa ha dimostrato che il rapporto di cellule in metafase è aumentato significativamente dopo il trattamento di 50 nM, 100 nM, 400 nM, 2 μM e 10 μM GSK923295 (Figura 4E,F). Inoltre, rispetto al significativo aumento dei cromosomi disallineati nelle cellule HeLa wild-type, le cellule HeLa clone 1 CENP-E-/- non sono state influenzate da diverse concentrazioni di GSK923295. Nel complesso, questa linea cellulare CENP-E-/- Clone 1 è un tipo specifico di linea cellulare resistente all'GSK923295, che non risponde agli inibitori di CENP-E a causa della delezione e dell'adattamento di CENP-E, della ridondanza genetica34 e dei potenziali effetti di compensazione genetica35,36,37. Questi risultati dimostrano che la cellula CENP-E-/- Clone 1 HeLa è uno strumento potente e utile per convalidare la specificità, la tossicità e gli effetti collaterali degli inibitori di CENP-E.

Figure 1
Figura 1: La costruzione di celle CENP-E-/- HeLa utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. (A) Cronologia del protocollo per la costruzione, la trasfezione, la formazione e la selezione di cloni cellulari e le validazioni funzionali di vettori CRISPR/Cas9. Timeline per la costruzione delle linee cellulari CENP-E-/-, inclusa la progettazione di sgRNA, la costruzione del plasmide pX458-sgRNA e lo screening di cellule mutanti. (B) Un modello schematico del clonaggio di sgRNA nel vettore pX458 linearizzato. L'esone 1 e l'esone 13 del gene CENP-E nel cromosoma 4 sono stati selezionati come siti bersaglio. (C) Meccanismi del sistema CRISPR/Cas9 per l'editing genetico. DSB seguita da un'unione di estremità non omologa genera tre mutazioni casuali, tra cui l'inserzione, la delezione e la sostituzione. (D) Immagini rappresentative in fluorescenza di cellule HeLa trasfettate con pX458-sgRNA1 (Target 1) e pX458-sgRNA2 (Target 2). Barre di scala = 50 μm. (E) Elettroforesi rappresentativa su gel di agarosio del DNA genomico nel controllo, nel bersaglio 1 e nel bersaglio 2. (F-H) Risultati della sequenziazione Sanger delle regioni target nei gruppi di controllo, Clone 1 e Clone 3. L'amplificazione PCR è stata effettuata utilizzando i primer diretti e inversi specifici per il locus bersaglio in cellule isolate Clone 1 e Clone 3. I frammenti di DNA sono stati clonati in vettori pMD18-T e trasfettati in DH5α E. coli per la formazione di cloni e il sequenziamento di Sanger. Vengono mostrati i risultati rappresentativi del sequenziamento. Nelle cellule HeLa clone 1, c'è stata un'inserzione di + 1 bp a 28 bp. Nelle cellule HeLa clone 2, c'è stato anche un inserimento di + 1 bp a 28 bp. Nel clone 3, c'è stata una delezione di -7 bp a 1.102-1.108 bp. Nel clone 4, c'è stata una delezione di -1 bp a 1.102 bp. Queste due mutazioni provocano entrambe una mutazione frameshift e un arresto prematuro delle proteine CENP-E. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: La costruzione e la strategia di screening basata sul fenotipo di linee cellulari HeLa knockout per CENP-E mediate da CRISPR/Cas9. (A) La strategia di screening si basa sulle colonie cellulari. Rispetto al gruppo di controllo, le cellule knockout CENP-E hanno mostrato un aumento significativo delle cellule in divisione. Barra della scala = 50 μm. (B) La strategia di screening si basa sull'allineamento cromosomico. Rispetto al gruppo di controllo, le cellule knockout CENP-E hanno mostrato un aumento del disallineamento cromosomico. Diversi cromosomi sono stati localizzati prossimalmente al polo del fuso dopo la delezione di CENP-E. DAPI, blu. Barra della scala = 10 μm. (C) La strategia di screening si basa sull'intensità di fluorescenza delle proteine CENP-E. CENP-E, verde. Barra della scala = 10 μm. (D) La costruzione del sistema CRISPR/Cas9. L'sgRNA specifico per CENP-E è stato legato nel plasmide pX458 e sequenziato per la validazione. Il plasmide pX458-sgRNA è stato trasfettato in cellule HeLa utilizzando un reagente di trasfezione e coltivato per 48 ore. Le cellule sono state lisate utilizzando tripsina/EDTA allo 0,25%, seminate nella piastra a 96 pozzetti e coltivate per la formazione di colonie cellulari. (E) Immagini rappresentative di immunofluorescenza di CENP-E e α-tubulina nei gruppi di controllo e CENP-E-/-. DAPI, blu; CENP-E, verde; α-tubulina, rossa. Barra della scala = 10 μm. (F) I rapporti delle cellule in metafase con cromosomi disallineati nel gruppo di controllo e nei gruppi CENP-E-/-. Controllo, 0,30 ± 0,21%, n = 9; Clone 1, 4,15 ± 0,57%, n = 9; Clona 3, 5,85 ± 0,80%, n = 9. (G) I rapporti delle cellule in metafase nei gruppi di controllo e CENP-E-/-.  Controllo, 3,49 ± 0,47%, n = 9; Clone 1, 5,86 ± 0,57%, n = 9; Clone 2, 6,70 ± 0,77%, n = 9. (H) I rapporti delle celle interfasiche nei gruppi di controllo e CENP-E-/-. Controllo, 70,08 ± 2,71%, n = 7; Clone: 1, 86,77 ± 0,91%, n = 7; Clone: 3, 87,67 ± 0,91%, n = 7. (I) Analisi dell'indice mitotico dei gruppi di controllo e CENP-E-/-, inclusi i rapporti delle cellule di profase, metafase, anafase e telofase. (J) Immagini rappresentative in immunofluorescenza di BubR1 e CENP-B nei gruppi di controllo e CENP-E-/-. DAPI, blu; BubR1, verde; CENP-B, rosso. Barra della scala = 10 μm. (K) Analisi line-scan di BubR1 e CENP-B nei gruppi di controllo e CENP-E-/-. L'asse X indica la distanza relativa. L'asse Y indica l'intensità della fluorescenza. (L) Intensità di fluorescenza relativa di BubR1 (intensità di fluorescenza di BubR1 ai cinetocori/intensità di fluorescenza di BubR1 nel citoplasma) nei gruppi di controllo e CENP-E-/-. Controllo, 1,44 ± 0,10, n = 16; Clone 1, 0,98 ± 0,07, n = 18. Per tutti i grafici, è stata mostrata la media ± SEM. Nella Figura 2F-I, i test di confronto multiplo di ANOVA Dunnett. ns, p > 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001. Nella Figura 2L, il test t di Student spaiato. , p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Saggi di crescita cellulare di cellule HeLa knockout per CENP-E , tra cui la formazione di colonie cellulari, il saggio di vitalità cellulare e l'analisi del cariotipo. (A) Immagini rappresentative della colonia cellulare nei gruppi di controllo e CENP-E-/-.  Barra della scala = 50 μm. (B) Colorazione rappresentativa in cristallo violetto della colonia cellulare nei gruppi di controllo e CENP-E-/- . Barra della scala = 1 cm. (C) Il numero di celle per clone nei gruppi wild-type (controllo) e CENP-E-/-.  Wild-type, 81,97 ± 4,09, n = 32; Clone 1, 31,52 ± 2,51, n = 33; Clone 2, 13,97 ± 1,31, n = 33. Clone 3, 48,48 ± 3,01, n = 33; Clone 4, 33,39 ± 1,87, n = 33. (D) La vitalità cellulare relativa della colonia cellulare è stata misurata mediante assorbanza viola cristallina aA 600 nm. Wild-type, 0,42 ± 0,00, n = 6; Clone: 1, 0,12 ± 0,00, n = 6; Clona 2, 0,13 ± 0,00, n = 6. Clone: 3, 0,18 ± 0,00, n = 6; Clona 4, 0,12 ± 0,00, n = 6. (E) La vitalità cellulare dei gruppi wild-type e CENP-E-/- utilizzando il saggio MTS e di vitalità cellulare. Wild-type, 1,05 ± 0,00, n = 8; Clone 1, 0,77 ± 0,01, n = 8; Clona 2, 0,67 ± 0,01, n = 7. Clone 3, 0,79 ± 0,00, n = 7; Clona 4, 0,66 ± 0,01, n = 7. (F) Il numero di cromosomi per cellula nei gruppi wild-type e CENP-E-/-.  Wild-type, 67,09 ± 0,50, n = 66; Clone 1, 61,68 ± 0,83, n = 105; Clone, 2, 56,08 ± 0,6, n = 106. Clone 3, 61,28 ± 0,63, n = 90; Clone 4, 64,18 ± 0,83, n = 61. (G) Immagini rappresentative della diffusione cromosomica nel gruppo di controllo e nel gruppo CENP-E-/-. Barra della scala = 10 μm. Per tutti i grafici, i test di confronto multiplo di ANOVA Dunnett. Barre di errore, media ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Utilizzo di cellule HeLa knockout per CENP-E per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori di CENP-E. (A) Colorazione rappresentativa in cristallo violetto dei gruppi di controllo e CENP-E-/- dopo il trattamento di diverse concentrazioni di GSK923295. Barra della scala = 1 cm. (B) Immagini rappresentative della colonia cellulare nei gruppi di controllo e CENP-E-/-dopo  il trattamento con diverse concentrazioni di GSK923295. Barra di scala = 50 μm. (C) I diametri delle colonie cellulari nel gruppo di controllo dopo il trattamento di diverse concentrazioni di GSK923295. Controllo, 28,68 ± 0,85 μm, n = 149; 10 nM, 25,40 ± 0,86 μm, n = 223; 25 nM, 26,07 ± 0,68 μm, n = 255; 50 nM, 26,41 ± 0,60 μm, n = 180; 100 nM, 16,02 ± 0,32 μm, n = 185; 200 nM, 15,61 ± 0,29 μm, n = 185. (D) I diametri delle colonie cellulari nei gruppi CENP-E-/- dopo il trattamento di diverse concentrazioni di GSK923295. Clone 1, 17,64 ± 0,40 μm, n = 230; 10 nM, 17,98 ± 0,39 μm, n = 230; 25 nM, 15,03 ± 0,26 μm, n = 230; 50 nM, 16,14 ± 0,32 μm, n = 230; 100 nM, 21,13 ± 0,42 μm, n = 230; 200 nm, 19,00 ± 0,40 cm, n = 230. (E) Immagini rappresentative in immunofluorescenza della α-tubulina nei gruppi di controllo e CENP-E-/- dopo il trattamento con diverse concentrazioni di GSK923295, DAPI, blu. α-tubulina, verde. Barra della scala = 10 μm. (F) I rapporti delle cellule in metafase nel gruppo di controllo e nel gruppo CENP-E-/- dopo il trattamento con diverse concentrazioni di GSK923295. (G) I rapporti delle cellule in metafase con cromosomi disallineati nei gruppi di controllo e CENP-E-/- dopo il trattamento con diverse concentrazioni di GSK923295. Per tutti i grafici, i test di confronto multiplo di ANOVA Dunnett. Barre di errore, media ± SEM. ns, p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Kinesin-7 CENP-E è un regolatore chiave nell'allineamento cromosomico e nel checkpoint dell'assemblaggio del fuso durante la divisione cellulare 17,19,20. La delezione genetica di CENP-E di solito provoca l'attivazione del checkpoint dell'assemblaggio del fuso, l'arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare 27,29,51,52. Pertanto, la costruzione di linee cellulari knockout stabili per CENP-E è un'importante questione irrisolta nella biologia di CENP-E. In questo studio, le cellule HeLa knockout CENP-E sono state generate con successo utilizzando il sistema CRISPR/Cas9. Questo studio ha stabilito tre strategie di screening ottimizzate basate sul fenotipo - screening delle colonie cellulari, fenotipi di allineamento cromosomico e intensità fluorescenti delle proteine CENP-E - che migliorano significativamente l'efficienza e il tasso di successo delle cellule knockout CENP-E.

Ci sono diversi passaggi cruciali in questo studio. In primo luogo, la progettazione di sgRNA ottimizzati è essenziale per ridurre al minimo gli effetti off-target. In secondo luogo, la trasfezione dei plasmidi CRISPR in cellule in coltura attraverso reagenti a base lipidica, elettroporazione o trasfezione di lentivirus può migliorare l'efficienza di trasfezione e i rapporti delle cellule knockout geniche. Inoltre, le applicazioni di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza 53,54,55 e selezione della puromicina56,57 accelererebbero la velocità dello schermo e ridurrebbero il periodo sperimentale. In terzo luogo, la validazione dei fenotipi knockout genici può essere soddisfatta mediante PCR, western blot, saggi di immunofluorescenza e sequenziamento del DNA genomico. In quarto luogo, l'analisi funzionale dei fenotipi knockout di CENP-E può essere studiata utilizzando una varietà di saggi, tra cui saggi di proliferazione cellulare, immunofluorescenza, analisi del ciclo cellulare e imaging ad alta risoluzione.

Rispetto alle tradizionali tecnologie di editing genomico, come ZFN e TALEN, il sistema CRISPR/Cas9 presenta diversi vantaggi, tra cui semplicità, alta efficienza, facilità di personalizzazione, versatilità e capacità multiplex10. Inoltre, il sistema CRISPR/Cas9 può essere scalato verso l'alto per lo screening ad alto rendimento e per progetti di ingegneria su larga scala58,59. Il sistema CRISPR/Cas9 è stato anche adattato come un'efficiente tecnologia di editing genetico che consente mutazioni in un solo passaggio in più geni60, il che accelera gli studi di geni funzionalmente ridondanti, geni interagenti e malattie genetiche poligeniche. Inoltre, il sistema CRISPR/Cas9 può essere migliorato nella sua efficienza e versatilità8. La via HDR ad alta fedeltà, una via alternativa di riparazione del DNA principale, può essere utilizzata per mediare l'editing genico preciso nel locus bersaglio nelle cellule in divisione in futuro10. Inoltre, la co-trasfezione di più sgRNA può provocare l'ampia delezione e il completo knockout di CENP-E nelle cellule, il che migliora la stabilità e l'affidabilità delle cellule knockout di CENP-E.

Una limitazione chiave del sistema CRISPR/Cas9 è che SpCas9 è incline alla mutagenesi off-target, che occasionalmente prende di mira i siti non intenzionali nel genoma e porta a effetti off-target. Questo può essere ridotto al minimo migliorando la progettazione dell'RNA guida, gli algoritmi di predizione off-target e il sequenziamento dell'intero genoma10,59. Diversi approcci, tra cui l'uso di proteine Cas12a o Cas13alternative 53, l'uso di editor di basi61 e la somministrazione di proteine Cas9 e RNA guida12, sono stati sviluppati per ridurre gli effetti off-target. La seconda limitazione è che lo Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), ampiamente utilizzato, richiede un requisito di 5'-NGG PAM per il riconoscimento dei loci bersaglio, il che limita la selezione dei siti bersaglio di SpCas9 nei genomi. Lo sviluppo di varianti ingegnerizzate di SpCas9 che riconoscano i PAM rilassati o diversificati potrebbe aumentare l'intervallo target di Cas9 nella cassetta degli attrezzi 62,63,64 per l'ingegneria genomicaCRISPR/Cas9. Inoltre, in diversi casi, il sistema CRISPR/Cas9 porta al mosaicismo e provoca modifiche diverse nelle popolazioni cellulari65. Alcuni animali possono stimolare una risposta immunitaria alle proteine Cas9, che ne limita le applicazioni in alcune specie12,66. Nonostante queste limitazioni, il sistema CRISPR/Cas9 rimane una potente tecnologia di editing genetico per l'editing del genoma e lo studio delle funzioni geniche nella scienza di base, nella biotecnologia, nella terapia genica e nella medicina.

Le modalità di interazione e i meccanismi molecolari di CENP-E e dei suoi inibitori sono importanti campi di ricerca nella biologia cellulare e nella ricerca sul cancro. La mutagenesi sito-diretta e gli studi di biologia molecolare hanno rivelato che GSK923295 interagisce con Ile182 e Thr183 e con le proteine CENP-E, essendo inserito tra le eliche α2 e α3 e vicino al loop 525. In questo studio, la linea cellulare CENP-E knockout HeLa è stata stabilita come un valido strumento per la validazione della specificità e della tossicità degli inibitori di CENP-E. Ad oggi, i siti di legame e i meccanismi della maggior parte degli inibitori di CENP-E non sono ben compresi. Le combinazioni di spettrometria di massa molecolare67, spettroscopia di risonanza magnetica nucleare68, pinzette ottiche69, modifiche della struttura molecolare, cristallografia a raggi X70 e microscopia crioelettronica71,72 contribuirebbero a chiarire i siti di interazione e i meccanismi di inibizione di CENP-E. In futuro, la modifica del bersaglio mediata dalla riparazione diretta dall'omologia di CENP-E in siti specifici può generare le cellule di editing genico CENP-E, che aiuterebbero a rivelare i siti di legame specifici e i meccanismi degli inibitori specifici di CENP-E.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Citoscheletro dell'Università di Medicina del Fujian per le utili discussioni. Ringraziamo Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke del Centro di Insegnamento Sperimentale di Scienze Mediche di Base presso l'Università di Medicina del Fujian per il loro supporto. Questo studio è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 82001608 e 82101678), Natural Science Foundation della provincia del Fujian, Cina (numero di sovvenzione 2019J05071), i fondi congiunti per l'innovazione della scienza e della tecnologia, la provincia del Fujian, Cina (numero di sovvenzione 2021Y9160) e il progetto di finanziamento per la ricerca scientifica di talenti di alto livello della Fujian Medical University (numero di sovvenzione XRCZX2017025).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

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References

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Biologia Edizione 196 CENP-E Knockout Proteina-E associata al centromero Kinesina Cattura cinetocore-microtubuli Allineamento cromosomico Checkpoint di assemblaggio del fuso Cellule HeLa Screening basato sul fenotipo Disallineamento cromosomico Checkpoint mitotico BUB1 Serina/treonina chinasi B (BubR1) Difetti mitotici
Generazione di linee cellulari <em>knockout CENP-E<sup>-/-</sup></em> associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9
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Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang,… More

Xu, M. F., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J. L., Zhou, Y., He, J. J., Wu, S., Wei, Y. L., She, Z. Y. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).

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