Generation of Centromere-Associated Protein-E <em>CENP-E<sup>-/-</sup></em> Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

Meng-Fei Xu; Jie Chen; Yue Xu; Jing-Lian Zhang; Yi Zhou; Jie-Jie He; Shan Wu; Ya-Lan Wei; Zhen-Yu She

doi:10.3791/65476

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Biologie

CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 Centromere-Associated Protein-E CENP-E^-/- Knockout 세포주 생성

Published: June 23, 2023

doi:

10.3791/65476

Meng-Fei Xu², Jie Chen², Yue Xu², Jing-Lian Zhang², Yi Zhou², Jie-Jie He², Shan Wu², Ya-Lan Wei⁴, Zhen-Yu She²

¹Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, ²Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine,Fujian Province University, ³College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics,Fujian Medical University, ⁴Medical Research Center,Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

이 논문은 CRISPR/Cas9 시스템과 세 가지 표현형 기반 스크리닝 전략을 사용하여 중심체 관련 단백질-E(CENP-E) 녹아웃 세포의 구축을 보고합니다. 당사는 CENP-E 녹아웃 세포주를 활용하여 약물 개발 및 생물학 연구에 유용한 CENP-E 억제제의 특이성과 독성을 검증하기 위한 새로운 접근법을 확립했습니다.

Abstract

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 다양한 유기체에서 정밀하고 효율적인 유전자 편집을 위한 강력한 도구로 부상했습니다. Centromere-associated protein-E(CENP-E)는 키네토코어-미세소관 포획, 염색체 정렬 및 스핀들 어셈블리 체크포인트에 필요한 플러스 말단 지향 키네신입니다. CENP-E 단백질의 세포 기능은 잘 연구되어 왔지만, CENP-E 절제는 일반적으로 방추체 어셈블리 체크포인트 활성화, 세포 주기 정지 및 세포 사멸로 이어지기 때문에 기존 프로토콜을 사용하여 CENP-E 단백질의 직접적인 기능을 연구하는 것은 어려웠습니다. 이 연구에서는 인간 HeLa 세포에서 CENP-E 유전자를 완전히 녹아웃하고 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 CENP-E^-/- HeLa 세포를 성공적으로 생성했습니다.

세포 콜로니 스크리닝, 염색체 정렬 표현형, CENP-E 단백질의 형광 강도를 포함한 세 가지 최적화된 표현형 기반 스크리닝 전략이 수립되어 CENP-E 녹아웃 세포의 스크리닝 효율성과 실험 성공률을 효과적으로 개선했습니다. 중요하게도, CENP-E 결실은 염색체 부정합, BUB1 유사분열 체크포인트 세린/트레오닌 키나아제 B (BubR1) 단백질의 비정상적인 위치 및 유사분열 결손 귀착됩니다. 또한 CENP-E knockout HeLa 세포 모델을 활용하여 CENP-E 특이적 억제제에 대한 식별 방법을 개발했습니다.

이 연구에서는 CENP-E 억제제의 특이성과 독성을 검증하는 유용한 접근 방식이 확립되었습니다. 또한 이 논문은 세포 분열에서 CENP-E의 메커니즘을 조사하는 강력한 도구가 될 수 있는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 CENP-E 유전자 편집 프로토콜을 제시합니다. 또한 CENP-E 녹아웃 세포주는 항종양 약물 개발, 세포 생물학의 세포 분열 메커니즘 연구 및 임상 적용에 중요한 영향을 미치는 CENP-E 억제제의 발견 및 검증에 기여할 것입니다.

Introduction

조작된 게놈 편집은 다양한 세포와 유기체에서 유전자의 표적 변형을 매개합니다. 진핵생물에서, 부위 특이적 돌연변이 유발은 표적 DNA의 상동 재조합을 자극하는 서열 특이적 뉴클레아제의 응용에 의해 도입될 수^{있다 1}. 최근 몇 년 동안 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)^2,3, 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)^4,5 및 귀환 메가뉴클레아제(^6,7)를 포함한 여러 게놈 편집 기술이 특정 부위에서 게놈을 절단하도록 설계되었지만 이러한 접근 방식에는 복잡한 단백질 엔지니어링과 중복 실험 절차가 필요합니다. 학문은 유형 II 원핵생물 군집된 규칙적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)/Cas 체계가 특히 다양한 세포 및 종 8,9,10,11에 있는 RNA 인도한, 위치 특정한 DNA 절단을 중재하는 능률적인 유전자 편집 기술이다는 것을 보여주었습니다. CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃 기술은 기초 생물학, 생명공학 및 의학 분야에 혁명을 일으켰습니다¹².

박테리아와 대부분의 고세균은 바이러스와 플라스미드를 식별하고 파괴하기 위해 CRISPR 및 Cas 단백질을 사용하는 RNA 기반 적응 면역 시스템을 진화시켰다¹³. 연쇄상구균 화농균 Cas9(SpCas9) 엔도뉴클레아제는 CRISPR RNA(crRNA)를 포함하는 합성 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 제공하고 trans-activating crRNA(tracrRNA^)를 제공하여 염기서열 특이적 이중 가닥 절단(DSB)을 효율적으로 매개할 수 있는 RuvC 유사 Holliday 접합 리졸버제(RuvC) 및 His-Asn-His(HNH) 도메인을 포함합니다. DSB는 포유류 세포에서 삽입, 결실 또는 흉터가 없는 단일 뉴클레오티드 치환을 포함한 다중 돌연변이를 유발하는 indel-forming non-homologous end joining(NHEJ) 또는 homology-directed repair(HDR) 경로를 통해 복구될 수 있습니다 ^1,8. 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ와 고충실도 HDR 경로 모두 삽입 또는 결실을 통해 유전자 knockout을 매개하는 데 사용할 수 있으며, 이는 프레임시프트 돌연변이 및 조기 정지 코돈을 유발할 수 있다¹⁰.

Kinesin-7 CENP-E는 세포 분열 중 키네토코어-미세소관 부착 및 염색체 정렬에 필요합니다 17,18,19. CENP-E의 항체 미세주입^20,21, siRNA 고갈^22,23, 화학적 억제 24,25,26 및 유전자 결실 27,28,29는 염색체 정렬 불량, 방추체 조립 체크포인트의 활성화 및 유사분열 결함을 유발하여 이수성 및 염색체 불안정성^19,30을 초래합니다. 마우스에서 CENP-E 결실은 발달 초기 단계에서 비정상적인 발달 및 배아 치사율을 초래합니다 27,29,31. CENP-E의 유전적 결실은 일반적으로 염색체 정렬 불량과 세포 사멸을 초래하며, 이는 CENP-E 단백질의 기능과 메커니즘을 연구하는 데 장애가 됩니다 26,27,29.

최근 연구에서는 옥신 유도 CRISPR/Cas9 유전자 편집 방법(³²)을 사용하여 조건부 CENP-E 녹아웃 세포주를 확립했으며, 이는 비교적 짧은 시간에 CENP-E 단백질을 빠르게 분해할 수 있습니다³³. 그러나 현재까지 안정적인 CENP-E knockout 세포주는 확립되지 않았으며, 이는 CENP-E 생물학에서 해결되지 않은 기술적 과제입니다. 유전적 강건성(genetic robustness)³⁴, 유전적 보상 반응^{(genetic compensation response)35,36,37} 및 복잡한 세포 내 환경을 고려할 때, CENP-E의 완전한 결실의 직접적인 결과는 복잡하고 예측할 수 없기 때문에, 염색체 정렬, 방추체 어셈블리 체크포인트(spindle assembly checkpoint) 및 다운스트림 신호전달 경로(downstream signaling pathway)의 메커니즘을 조사하기 위해 CENP-E knockout 세포주를 확립하는 것이 중요하다.

CENP-E 억제제의 발견과 응용은 암 치료에 중요합니다. 현재까지 GSK923295 및 그 유도체^24,25, PF-2771^38,39, 이미다조[1,2-a]피리딘 스캐폴드 유도체^40,41, 화합물-A^42,43, 신텔린^44,45, UA62784⁴⁶ 및 벤조[d]피롤로[2,1-b]티아졸 유도체⁴⁷을 포함하여 7가지 유형의 CENP-E 억제제가 발견되고 합성되었습니다. 이러한 억제제 중 GSK923295는 CENP-E의 운동 영역에 결합하고 3.2 ± 0.2 nM^24,25의_Ki 로 CENP-E 미세소관 자극 ATPase 활성을 억제하는 알로스테릭하고 효율적인 CENP-E 억제제입니다. 그러나 배양된 암세포에 대한 GSK923295의 억제 효과와 비교할 때, 임상적 암 환자에 대한 GSK923295의 치료 효과는 이상적이지 않으며^48,49 이는 CENP-E에 대한 GSK923295의 특이성에 대한 우려를 불러일으켰다. 또한 CENP-E 단백질에 대한 다른 CENP-E 억제제의 특이성과 부작용은 암 연구의 핵심 문제입니다.

이 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 HeLa 세포에서 CENP-E 유전자를 완전히 제거했습니다. CENP-E 유전자 편집의 스크리닝 효율성과 성공률을 개선하기 위해 세포 집락 스크리닝, 염색체 정렬 표현형, CENP-E 단백질의 형광 강도를 포함한 세 가지 최적화된 표현형 기반 스크리닝 전략이 수립되었습니다. 또한 CENP-E knockout 세포주를 사용하여 CENP-E에 대한 후보 화합물의 특이성을 테스트할 수 있습니다.

Protocol

1. CRISPR/Cas9 유전자 knockout 벡터의 구성 인간 CENP-E 유전자의 표적 게놈 DNA 염기서열을 선택합니다(GenBank Accession No. NM_001286734.2) 온라인 CRISPR 설계 도구(http://crispor.tefor.net/)를 사용하여 sgRNA를 설계합니다. 단일 게놈 염기서열을 입력하고, “Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148″의 게놈을 선택하고, protospacer 인접 모티프…

Representative Results

CENP-E-/- HeLa 세포는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 성공적으로 생성되었습니다(그림 1). 이 방법의 타임라인과 중요한 실험 단계는 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, CENP-E 특이적 sgRNA를 설계 및 합성하고, sgRNA를 pX458 플라스미드에 어닐링 및 접합하고, 플라스미드를 HeLa 세포로 transfection하고, 48시간 동안 배양했습니다. 형질주입된 세포?…

Discussion

Kinesin-7 CENP-E는 세포 분열 17,19,20 중 염색체 정렬 및 방추체 조립 체크포인트의 핵심 조절자입니다. CENP-E의 유전적 결실은 일반적으로 방추체 조립 체크포인트, 세포주기 정지 및 세포 사멸의 활성화를 초래합니다 27,29,51,52. 따라서…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

유익한 토론을 해주신 Fujian Medical University의 세포골격 연구소의 모든 구성원에게 감사드립니다. 기술 지원을 제공해 주신 Fujian Medical University Public Technology Service Center의 Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin, Min-Xia Wu에게 감사드립니다. Fujian Medical University의 기초 의학 실험 교육 센터의 Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(보조금 번호 82001608 및 82101678), 중국 푸젠성 자연과학재단(보조금 번호 2019J05071), 중국 푸젠성 과학기술혁신공동기금(보조금 번호 2021Y9160), 푸젠 의과대학 고급 인재 과학 연구 창업 자금 지원 프로젝트(보조금 번호 XRCZX2017025)의 지원을 받았습니다.

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H₂O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

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Xu, M., Chen, J., Xu, Y., Zhang, J., Zhou, Y., He, J., Wu, S., Wei, Y., She, Z. Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E^-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (196), e65476, doi:10.3791/65476 (2023).