Bir Fare Kanser Modelinde Venöz Tromboz Testi
Summary
Bu makale, venöz ligasyon elde etmek için vasküler klipsler kullanarak bir fare kanseri modelinde venöz trombozu değerlendirmek için optimize edilmiş bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır. Optimizasyon, trombozla ilişkili ölçümlerdeki değişkenliği en aza indirir ve insan kanseriyle ilişkili venöz trombozla alaka düzeyini artırır.
Abstract
Bu metodoloji makalesi, özellikle kanserle ilişkili tromboz (CAT) bağlamında, bir kemirgen venöz tromboz modelinin cerrahi nüanslarını vurgulamaktadır. Derin ven trombozu, kanserden kurtulanlarda sık görülen bir komplikasyondur ve potansiyel olarak ölümcül olabilir. Mevcut murin venöz tromboz modelleri tipik olarak bir sütür kullanılarak inferior vena kavanın (IVC) tam veya kısmi mekanik oklüzyonunu içerir. Bu prosedür, trombogenezi tetikleyen kan ve endotel hasarının tam veya kısmi durgunluğunu indükler. Mevcut modellerin pıhtı ağırlıklarında daha yüksek değişkenlik, önemli mortalite oranı ve uzamış öğrenme eğrisi gibi sınırlamaları vardır. Bu rapor, bu sınırlamaların bazılarını ele almak için vasküler klipsleri kullanan cerrahi iyileştirmeleri tanıtmaktadır. Sinjeneik kolon kanseri ksenogreft fare modeli kullanarak, infrarenal vena kavayı bağlamak için özelleştirilmiş vasküler klipsler kullandık. Bu klipsler, IVC ligasyonlarından sonra 5-0 polipropilen sütüre benzer şekilde rezidüel dudak boşluğuna izin verir. Sütür yöntemi ile fareler kontrol görevi gördü. Vasküler klips yöntemi, sütür yöntemine göre daha az değişkenlik ile tutarlı bir tekrarlanabilir parsiyel damar tıkanıklığı ve daha büyük pıhtı ağırlıkları ile sonuçlandı. Daha büyük pıhtı ağırlıkları, daha büyük pıhtı kütlesi ve IVC luminal yüzey alanına pıhtı, 6-0 polipropilen sütüre kıyasla vasküler kliplerin daha yüksek basınç profili nedeniyle bekleniyordu. Yaklaşım, sütür yöntemine kıyasla vasküler klipsli infrarenal vena kavada sürekli olarak daha fazla pıhtı kitlesi ortaya çıkaran gri skala ultrasonografi ile doğrulandı. Bu gözlemler, immünofloresan boyama ile daha da doğrulandı. Bu çalışma, farelerde bir venöz tromboz modeli oluşturmak için geliştirilmiş bir yöntem sunmaktadır ve bu, CAT’in mekanik anlayışını derinleştirmek için ve ilaç keşfi gibi translasyonel araştırmalarda kullanılabilir.
Introduction
Kanserle ilişkili venöz tromboembolizm (VTE)
Venöz tromboembolizm (VTE) riski, kanserden kurtulanlarda genel popülasyona göre 4 ila 7 kat daha yüksektir 1,2,3. Bu durum kanserli yedi hastadan birinde ölümcüldür. VTE insidansı, kanserin türüne ve tümör yüküne bağlı olarak değişir ve pankreas ve mide kanserli hastalar arasında en yüksektir4.
Kanser hastalarında kanserle ilişkili VTE’nin prognostik önemi vardır. Kanser teşhisinden sonraki ilk yılda, yaş, ırk ve altta yatan kanserin evresine göre ayarlandıktan sonra bile, olumsuz genel sağkalım ile ilişkilidir5. Bu bulgular, kanserle ilişkili VTE’nin incelenmesinin önemini ve bir hayvan modeli kullanarak mekanizmasını araştırma ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu alanın translasyonel önemi, kanser hastalarında VTE’nin tromboprofilaksi ve antitrombotik tedavi ile önlenebilir ve tedavi edilebilir olması gerçeğiyle daha da vurgulanmaktadır6.
Kanser ve venöz trombozun hayvan modelleri
Kanser modelleri, geleneksel olarak farelerde kanser hücrelerinin enjeksiyonunu gerektiren ksenogreftler olarak adlandırılır. Kanser hücrelerinin orijini gibi bir bölgeye enjeksiyonu ortotopik model olarak adlandırılırken, farklı bir bölgede (kanat üzerinde deri altı düzlemi) heterotopik model olarak bilinir. Kanser hücrelerinin köken türü, onları HT-29 hücre hattı (insan kolon kanseri) gibi allojenik bir model olarak belirler7,8,9. Aksine, sinjeneik modeller, RenCa ve MC-38 hücre hatları 3,10 dahil olmak üzere murin kanseri hücre hatlarını kullanır.
Literatürde kemirgenlerde arteriyel, venöz ve kapiller tromboz modelleri tanımlanmıştır. Venöz tromboz, inferior vena kavada (IVC) mekanik yaralanma (kılavuz tel) veya tam IVC ligasyonu, kimyasal (Ferrik klorür) veya elektrolitik yaralanma ile indüklenir. Ferrik klorür kaynaklı tromboz veya IVC ligasyonu, tam oklüzyon modellerini temsil eder. Sonuncusu, damarlarda kan ve enflamatuar infiltratların durgunluğuna neden olur11,12,13. Tam ligasyon modeli, farelerin %95 ila %100’ünde yüksek oranda tromboz oluşumu ile sonuçlanır. Parsiyel IVC ligasyon modeli, lateral iliolumbar dalların kesilmesini içerebilir ve IVC12’nin distal hedef noktalarına sütür ligasyonları uygulanarak venöz dönüş ortadan kaldırılır. Bazen, venöz dönüşü kısmen kesmek için bir boşluk tutucu kullanılır. Bununla birlikte, mevcut parsiyel oklüzyon modelinde trombüs ağırlığı tutarsızdır, bu da pıhtı ağırlıklarında ve yüksekliklerinde yüksek değişkenliğe neden olur12,14.
Bu büyük damar mekanik modellerinin her ikisinin de (kısmi ve komple) sınırlamaları vardır. İlk olarak, IVC ligasyonu (staz modeli) sıklıkla hipotansiyona neden olur. Kan, vertebral damarlardan şant edilir. Deneyimli ellerde olmasına rağmen, bu modelde ölüm oranı %5-%30 arasında değişmekte olup, öğrenme eğrisi sırasında daha yüksek oran beklenmektedir. Daha da önemlisi, tam oklüzyon modeli, bir trombüsün tipik olarak tıkayıcı olmadığı insanlarda derin ven trombozunu (DVT) yeniden üretmez. Tam oklüzyonun hemoreolojik faktörleri ve farmakodinamik parametreleri değiştirmesi ve lokal bölgedeki bileşiklerin biyoyararlanımını değiştirmesi muhtemeldir. Bu sınırlamalar nedeniyle, tam oklüzyon modelleri, terapötik amaçlar ve ilaç keşifleri için yeni kimyasal bileşiklerin test edilmesi için uygun olmayabilir12.
Endotel hasarı ile azalmış akışa sahip klinik olarak anlamlı bir venöz tromboz murin modeli sağlamak için, DVT’nin endotel bozulması olmadığında kan akışının kısıtlanmasıyla tetiklendiği bir venöz tromboz modelinin tanıtıldığına dikkat edilmelidir. Model, taramalı elektron mikroskobu15 ile doğrulandı. Klinik olarak anlamlı bir tromboz modeli, ilaç keşiflerini mümkün kılan neredeyse tam trombozlu bir modeldir. Mevcut parsiyel oklüzyon modellerinde pıhtı oluşumu tutarsızdır, bu da pıhtı ağırlığı ve boylarında yüksek değişkenliğe neden olur12,16. Ayrıca, pıhtı ağırlığı geleneksel yöntemlerle değişkendir ve çalışma başına daha fazla fare gerektirir12.
Önceki kanserle ilişkili tromboz modelleri kolon, pankreas ve akciğer kanserine odaklandı ve hepsi tam oklüzyon modelleriydi17,18,19. Bu makale, daha düşük değişkenlik ve fare mortalitesi ile pıhtılar sağlamak için kısmi oklüzyon trombozu modelini değiştirmektedir (Şekil 1). Önceki çalışmalar, immün sistemi baskılanmış timik fareler arka planında allojenik kanser hücre dizilerini kullandı 19,20,21. Bu makale, C57Bl6/J farelerde immünkompetan farelerin kullanımına ve trombogeneze karşı immün bileşenlerin incelenmesine izin veren bir MC-38 hücre sinjeneik ksenogrefti kullanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinjeneik ksenogreft kolon kanseri modelinde, deney grubunda kontrol grubuna göre daha yüksek trombojenite ve pıhtılaşma belirteçlerinin ekspresyonlarını gözlemledik. Önemli olarak, tüm bu parametrelerdeki varyans, deney grubunda kontrol grubuna göre daha düşüktü. Modifikasyon, IVC ve sol renal venin birleşme noktasında spesifik bir basınç profiline sahip bir vasküler klipsin yerleştirilmesini içeriyordu. Klips, 5-0 polipropilen sütür olan bir ara parçanın üzerine yerleştirildi. Bu modifikasy…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma AHA Kardiyo-onkoloji SFRN CAT-HD Merkezi hibe 857078 (KR, VCC, XY ve SL) ve R01HL166608 (KR ve VCC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
Referenzen
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Krebsforschung. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Krebsforschung. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al. May-Thurner syndrome. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
