Summary

Визуализация живых клеток личинки Drosophila melanogaster третьего возраста

Published: June 23, 2023
doi:

Summary

Здесь мы обсуждаем рабочий процесс подготовки, препарирования, монтажа и изображения живого мозга эксплантата личинок третьего возраста Drosophila melanogaster для наблюдения за клеточной и субклеточной динамикой в физиологических условиях.

Abstract

Нервные стволовые клетки дрозофилы (нейробласты, далее NB) подвергаются асимметричному делению, регенерируя самообновляющийся нейробласт, а также образуя дифференцирующую ганглионарную материнскую клетку (GMC), которая претерпевает одно дополнительное деление, чтобы дать начало двум нейронам или глии. Исследования NB раскрыли молекулярные механизмы, лежащие в основе полярности клеток, ориентации веретена, самообновления и дифференцировки нервных стволовых клеток. Эти асимметричные клеточные деления легко наблюдаются с помощью визуализации живых клеток, что делает личинки NB идеально подходящими для исследования пространственно-временной динамики асимметричного деления клеток в живой ткани. При правильном препарировании и визуализации в среде, обогащенной питательными веществами, NB в мозге эксплантата надежно делятся в течение 12-20 часов. Ранее описанные методы технически сложны и могут быть сложными для новичков в этой области. Здесь описан протокол подготовки, вскрытия, монтажа и визуализации живых эксплантатов личинок третьего возраста с использованием добавок жирового тела. Также обсуждаются потенциальные проблемы и приводятся примеры того, как можно использовать эту технику.

Introduction

Асимметричное деление клеток (ACD) – это процесс, при котором субклеточные компоненты, такие как РНК, белки и органеллы, неравномерно распределяются между дочерними клетками 1,2. Этот процесс обычно наблюдается в стволовых клетках, которые подвергаются ACD, чтобы дать начало дочерним клеткам с различными судьбами развития. Дрозофила NB делятся асимметрично, образуя один NB, который сохраняет свою стволовость, и одну ганглионарную материнскую клетку (GMC). GMC подвергается дальнейшим делениям с образованием дифференцирующих нейронов или глии3. Асимметрично делящиеся NB в изобилии присутствуют в развивающемся мозге личинок третьего возраста, которые легко наблюдаются с помощью микроскопии. На личиночной стадии третьего возраста в каждой центральной доле мозга присутствует примерно 100 NB 3,4,5,6.

Асимметричное деление клеток является высокодинамичным процессом. Протоколы визуализации живых клеток использовались для измерения и количественной оценки динамики полярности клеток 7,8,9,10, ориентации веретена 11,12,13, динамики коры актомиозина 14,15,16,17,18, биологии микротрубочек и центросом 19,20,21,22,23,24,25,26,27, а также мембрана 10,28 и динамика хроматина29. Качественные и количественные описания ACD основаны на надежных методах и протоколах для визуализации деления NB в интактном живом мозге. В следующем протоколе описываются методы подготовки, вскрытия и визуализации личиночной мозга третьего возраста для визуализации живых клеток in vivo с использованием двух различных подходов к монтажу. Эти методы лучше всего подходят для исследователей, заинтересованных в пространственно-временной динамике делений стволовых клеток, а также делений в других клетках мозга, поскольку они позволяют проводить краткосрочные и долгосрочные наблюдения за клеточными событиями. Кроме того, эти методы легко доступны для новичков в этой области. Мы демонстрируем эффективность и адаптивность этого подхода с личиночным мозгом, экспрессирующим флуоресцентно меченные микротрубочки и корковые слитые белки. Кроме того, мы обсуждаем методы анализа и соображения по применению в других исследованиях.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны материалы, необходимые для проведения этого исследования. 1. Соображения и подготовка к эксперименту Не допускайте переполнения личинок.ПРИМЕЧАНИЕ: Качество мозга эксплантата личинок напрямую связано со…

Representative Results

Вскрытие и визуализация НБ центральной доли мозга, экспрессирующих Pins::EGFP и Cherry::JupiterЧтобы продемонстрировать этот протокол, личинки экспрессируют управляемый UAS Cherry::Jupiter13 и эндогенно помеченные Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) визуализирова…

Discussion

В этом протоколе изложен один из подходов к визуализации живого мозга эксплантатов личинок Drosophila melanogaster . Описанный здесь протокол позволяет наблюдать за мозгом эксплантата в течение 12-20 часов в правильных экспериментальных условиях. Особое внимание должно быть уделено подготов?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование поддерживается R35GM148160 (C.C.) и Национальным институтом здравоохранения (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R.C.S.)

Materials

0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane Genesee 25-231 Vacuum-driven filters
Agar Genesee 20-248 granulated agar
Analytical Computer Dell NA Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum HyClone SH30541.02
Chambered Imaging Slides Ibidi 80826
Confocal Microscope Nikon NA
Custom-machined metal slide NA NA See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes Fisher Scientific 5024343 3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps World Precision Instruments Dumont #5
Dissection Microscope Leica NA
Dissection Scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
Embryo collection cage Genesee 59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies Genesee 59-172
Gas-permeable membrane YSI 98095 Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides Electron Microscopy Sciences 72204-03 # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris Oxford Instruments NA Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter Oxford Instruments NA
Instant Yeast Saf-Instant NA
Molasses Genesee 62-117
Petri dish Greiner Bio-One 628161 60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly Vaseline NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid Millipore Sigma S0146
SlideBook acquisition software 3i NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter Genesee Scientific, GenClone 25-231

Referenzen

  1. Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
  2. Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
  3. Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  4. Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
  5. Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
  6. Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
  7. Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
  8. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  9. Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
  10. LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
  11. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Entwicklungsbiologie. 319 (1), 1-9 (2008).
  12. Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
  13. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  14. Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
  15. Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
  16. Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
  17. Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
  18. Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
  19. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
  20. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
  21. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  22. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  23. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  24. Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
  25. Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
  26. Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
  27. Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
  28. LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
  29. Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
  30. Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Entwicklungsbiologie. 475, 256-264 (2021).
  31. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
  32. Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
  33. Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
  34. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  35. Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
  36. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
  37. Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Segura, R. C., Cabernard, C. Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains. J. Vis. Exp. (196), e65538, doi:10.3791/65538 (2023).

View Video