Uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica
Summary
Este estudo fornece um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descreve métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica, esclarecendo a biologia mecânica esquelética.
Abstract
O osso alveolar, com alta taxa de rotatividade, é o osso que mais ativamente remodela o corpo. A movimentação dentária ortodôntica (MOT) é um processo artificial comum de remodelação óssea alveolar em resposta à força mecânica, mas o mecanismo subjacente permanece indefinido. Estudos anteriores não foram capazes de revelar o mecanismo preciso da remodelação óssea em qualquer tempo e espaço devido a restrições relacionadas ao modelo animal. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) é importante no metabolismo ósseo, mas seu papel nos osteoblastos durante a OTM não é claro. Para fornecer evidências in vivo de que o STAT3 participa da OTM em momentos específicos e, em particular, em células durante a OTM, geramos um modelo de camundongo knockout Stat3 específico para linhagem osteoblástica induzível por tamoxifeno, aplicamos força ortodôntica e analisamos o fenótipo do osso alveolar.
Microtomografia computadorizada (Micro-CT) e microscopia estéreo foram utilizadas para acessar a distância OTM. A análise histológica selecionou a área localizada dentro das três raízes do primeiro molar (M1) na secção transversal do osso maxilar como a região de interesse (ROI) para avaliar a atividade metabólica de osteoblastos e osteoclastos, indicando o efeito da força ortodôntica sobre o osso alveolar. Em suma, apresentamos um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descrever métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a OTM, lançando assim uma nova luz sobre a biologia mecânica esquelética.
Introduction
Sabe-se que o osso está em constante reconstrução ao longo da vida, em resposta às forças mecânicas de acordo com a lei de Wolff 1,2. A estimulação mecânica adequada, como a gravidade e o exercício diário, mantém a massa e a força óssea e previne a perda óssea, estimulando tanto os osteoblastos quanto os osteoclastos. Os osteoclastos, responsáveis pela reabsorção óssea3,4,5,6,7, e os osteoblastos, responsáveis pela formação óssea8,9,10, mantêm a homeostase óssea e funcionam conjuntamente no processo biológico de remodelação óssea. Por outro lado, na ausência de estímulos de carga, como em astronautas sob microgravidade de longa duração, os ossos sofrem perda de densidade mineral óssea de 10%, aumentando o risco de osteoporose11,12. Além disso, terapias mecânicas não invasivas e convenientes, incluindo a ortodontia e a osteogênese por distração, têm surgido como tratamentos para doenças ósseas13,14. Tudo isso tem mostrado que a força mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da qualidade e quantidade óssea. Estudos recentes geralmente analisaram a remodelação óssea em resposta à carga mecânica utilizando modelos demorados, como testes de suspensão de roda corrida e de cauda, que geralmente levavam 4 semanas ou mais para simular carga ou descarga de força15,16. Portanto, há demanda por um modelo animal conveniente e eficiente para o estudo da remodelação óssea impulsionada pela carga de força.
O osso alveolar é o mais ativo em termos de remodelação óssea, com alta taxa de turnover17. A movimentação dentária ortodôntica (MOT), um tratamento comum para más oclusões, é um processo artificial de remodelação óssea alveolar em resposta à força mecânica. No entanto, o OTM, que induz rápida remodelaçãoóssea18, também é uma maneira de economizar tempo para estudar os efeitos da força mecânica na remodelação óssea em comparação com outros modelos com um longo período experimental. Portanto, o OTM é um modelo ideal para estudar a remodelação óssea sob estímulos mecânicos. Vale ressaltar que o mecanismo de remodelação óssea alveolar muitas vezes é sensível ao tempo, sendo necessário observar as mudanças na remodelação óssea alveolar em determinados momentos após a modelagem. Com as vantagens duplas do controle temporal e espacial da recombinação de DNA e da especificidade tecidual, um modelo de camundongo knockout de gene condicional induzível é uma escolha adequada para estudos de OTM.
Convencionalmente, a remodelação óssea alveolar mediada por OTM tem sido dividida em zonas de tensão envolvendo a formação óssea e zonas de pressão envolvendo a reabsorção óssea 19,20,21, que é mais detalhada, mas de difícil regulação. Além disso, Yuri e col. relataram que o tempo de formação óssea no OTM diferiu nos lados de tensão e compressão22. Além disso, um estudo anterior havia demonstrado que o primeiro molar poderia iniciar uma ampla remodelação do osso alveolar superior sob força ortodôntica, que não estava restrita às zonas de tensão epressão23. Portanto, selecionamos a área localizada dentro de três raízes de M1 no corte transversal do osso maxilar como a região de interesse (ROI) e descrevemos métodos para avaliar a atividade de osteoblastos e osteoclastos na mesma área para avaliar a remodelação óssea alveolar sob OTM.
Como fator de transcrição nuclear, o transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3) tem se mostrado crítico na homeostaseóssea24,25. Estudos prévios relataram baixa densidade mineral óssea e fraturas patológicas recorrentes em camundongos mutantes Stat3 26,27. Nosso estudo prévio demonstrou que a deleção do Stat3 em osteoblastos Osx+ causou malformação craniofacial e osteoporose, bem como fratura óssea espontânea28. Recentemente, fornecemos evidências in vivo com um modelo induzível de camundongo com deleção osteoblasto-específica Stat3 (Col1α2CreERT2; Stat3 fl/fl, doravante denominado Stat3Col1α2ERT2) que o STAT3 é fundamental na mediação dos efeitos da força ortodôntica que impulsiona a remodelação óssea alveolar29. Neste estudo, apresentamos métodos e protocolos para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descrevemos métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a OTM, esclarecendo assim a biologia mecânica esquelética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como a má oclusão está entre os distúrbios bucais mais comuns, prejudicando a respiração, a mastigação, a fala e até mesmo a aparência, a demanda por ortodontia vem aumentando a cada dia, com a incidência subindo de 70% para 93%, segundo levantamento epidemiológicoprévio31,32. Como acelerar a remodelação óssea alveolar para aumentar a eficiência do tratamento ortodôntico com segurança tornou-se um tópico quente nessa área; portanto, é necess…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949); a Fundação de Ciências Naturais de Xangai (21ZR1436900, 22ZR1436700); o Programa de Líder de Pesquisa Acadêmica/Tecnológica de Xangai (20XD1422300); Plano de Pesquisa Clínica da SHDC (SHDC2020CR4084); o Fundo de Pesquisa Interdisciplinar do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (JYJC201902, JYJC202116); a Equipe de Pesquisa em Inovação de Universidades Locais de Alto Nível em Xangai (SSMUZLCX20180501); o Fundo Disciplinar de Pesquisa nº. KQYJXK2020 do Nono Hospital do Povo, da Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai e da Faculdade de Estomatologia da Universidade Jiao Tong de Xangai; Projeto de Exploração Original do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (JYYC003); Projeto Duzentos Talentos da Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai; o Projeto de Pesquisa Cooperativa do Instituto de Biomateriais e Medicina Regenerativa Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (2022LHB02); o Projeto do Biobanco do Hospital do Nono Povo de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (YBKB201909, YBKB202216).
Materials
| 1x PBS | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P1020 | |
| 4% paraformaldehyde | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1101 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Anti-CTSK antibody | Santa Cruz | sc-48353 | |
| Anti-OPN antibody | R&D Systems, Minneapolis, MN, USA | AF808 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Closed-coil springs | Innovative Material and Devices, Shanghai, China | CS1006B | |
| Col1α2CreERT2 mice | A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. | ||
| Dexmedetomidine hydrochloride | Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site | ||
| EDTA | Beyotime Biotechanology | ST069 | |
| Embedding tanks | Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd | 80106-1100-16 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 100092183 | |
| ImageJ software | NIH, Bethesda, MD, USA | ||
| Mounting medium with DAPI | Beyotime Biotechanology | P0131 | |
| Mouse dissection platform | Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. | HK105 | |
| Paraffin | Sangon biotech Co., Ltd. | A601889 | |
| Primers for genotyping | Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC | ||
| Protease K | Sigma-Aldrich | 539480 | |
| Self-curing restorative resin | 3M ESPE, St. Paul, MN, USA | 712-035 | |
| Stat3fl/fl mice | GemPharmatech Co., Ltd | D000527 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| TRAP staining kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Tris-HCl | Beyotime Biotechanology | ST780 | |
| Universal tissue fixative | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1105 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10023418 | |
| Zoletil | VIRBAC |
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