종양 형성 중 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 배액 림프절 전이 모델
Summary
여기에 제시된 실험 설계는 림프절(LN) 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 생식 모델을 제공하며, 이는 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제합니다.
Abstract
림프절 배액의 종양 항원 특이적 CD8+ T 세포는 종양 형성 중 항종양 면역 반응을 증가시키는 데 축적되는 중요성을 얻습니다. 그러나 많은 경우 암세포는 림프절에서 전이성 유전자좌를 형성한 후 멀리 떨어진 장기로 전이됩니다. 국소 및 체계적인 CD8+ T 세포 반응이 LN 전이에 의해 어느 정도 영향을 받았는지는 아직 불분명합니다. 이를 위해 림프구성 맥락막염 바이러스(LCMV), 당단백질(GP) 및 클래스 I 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 H-2Db에 의해 제시된 GP 유래 펩타이드 GP33-41에 특이적인 T세포 수용체(TCR)를 보유한 P14 형질전환 마우스에서 유래한 대리 신생항원을 발현하는 B16F10-GP 흑색종 세포주와 결합된 murine LN 전이 모델을 설정했습니다. 이 프로토콜은 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 C57BL/6J 마우스에 B16F10-GP 세포를 피하 이식한 후 naive P14 세포로 입양 이식했습니다. 피하종양이 직경 약 5mm까지 커지면 원발성 종양을 절제하고, B16F10-GP 세포를 종양 배액 림프절(TdLN)에 직접 주입하였다. 그런 다음 LN 전이 과정에서 CD8+ T 세포의 역학을 모니터링했습니다. 종합적으로, 이 모델은 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 면역 반응을 정밀하게 조사하기 위한 접근 방식을 제공했습니다.
Introduction
암 면역 요법, 특히 면역 관문 차단(ICB)은 암 치료에 혁명을 일으켰습니다1. ICB는 종양미세환경(TME)에서 소진된 CD8+ T 세포에서 많이 발현되는 동산화 면역 수용체(PD-1, Tim-3, LAG-3, TIGIT 등)를 차단하여 소진된 CD8+ T 세포를 활성화시킨다2. 소진된 CD8+ T 세포의 이질성을 고려할 때, 축적된 증거에 따르면 TME가 아닌 배액 림프절(dLN)을 포함하여 말초에서 유래한 종양 특이적 CD8+ T 세포가 ICB 3,4,5,6,7,8의 효능을 매개하는 것으로 나타났습니다. 최근 TdLN 유래 TCF-1+TOX– 종양 특이적 기억 CD8+ T세포(TdLN-TTSM)는 기존 기억 T세포의 여러 기능적 특성을 구현하고 ICB 처리 시 자손 소진 세포로 더욱 확장 및 분화할 수 있는 ICB에 대한 진정한 반응체임이 확인되었다9. 전체적으로, 이러한 발견은 항종양 면역을 강화하는 데 있어 LN의 중요성을 확증했습니다.
림프절은 생물학적 신호뿐만 아니라 구조적 기초를 제공함으로써 종양 특이적 CD8+ T 세포의 프라이밍 및 활성화를 촉진하는 중요한 역할을 한다10. 여러 종류의 암세포는 체계적인 전파 전에 감시림프절(SLN, 원발성 종양을 배출하는 첫 번째 LN)을 심는 경우가 많다11. SLN 전이의 존재는 인간 암에서 좋지 않은 결과와 관련이 있으며 전임상 모델은 TdLN의 종양 세포가 림프관과 결절 12,13,14,15의 혈관을 통해 먼 장기로 퍼질 수 있음을 보여주었습니다. SLN 생검은 이제 많은 고형 종양 유형에서 후속 치료 결정을 안내하는 표준 절차로, 침범되지 않은 LN16,17의 불필요한 절제를 피할 수 있습니다. 침범된 LN의 경우에도, 국소 LN을 제거했을 때 국소 LN 절제술을 받지 않은 환자에 비해 전체 생존율이 개선되지 않았다는 것이 여러 연구에서 입증되었기 때문에 외과적 절제가 필요한지 여부와 시기에 대해서는 여전히 논란의 여지가 있다18,19. 한 가지 해석은 미세한 질병이 있는 전이성 LN(mLN)이 면역 세포를 교육하고 일부 치료 이점을 제공할 수 있는 능력을 유지할 수 있다는 것입니다. 따라서 LN 전이가 항종양 면역 반응, 특히 TdLN-TTSM의 특성과 기능에 어떤 영향을 미치는지 밝히는 것이 매우 중요합니다.
지금까지 전임상 및 임상 데이터 모두에서 mLN20의 일부 구조적 및 세포 변화가 밝혀졌습니다. 그러나 LN 전이 중 종양 특이적 CD8+ T 세포의 동적 변화는 설명되지 않았습니다. 따라서 추가 연구를 위해 LN 전이에 대한 설득력 있는 모델을 개발해야 합니다. 실제로, 여러 연구에서 다양한 방식으로 mLN 마우스 모델을 보고했습니다 14,21,22. 예를 들어, 겨드랑이 LN에서의 자발적 전이는 4T1 유방암 세포를 유방 지방 패드(22)에 이식함으로써 수행되었다. 또 다른 연구에서 Reticker-Flynn 등은 해리된 mLN 조직에서 배양된 종양 세포의 연속 접종(9회)을 통해 피하 원발성 종양에서 LN으로 확산될 확률이 높은 흑색종 세포주를 생성했습니다14. 일반적으로 사용되는 또 다른 모델은 종양 세포를 발판에 주입하여 제조되었으며 전이성 유전자좌는 오금 LN22에서 형성됩니다. 특히, 이러한 모델에서 LN 전이가 항상 충실한 것은 아니기 때문에 정확한 개입 시점을 평가하기가 어렵습니다.
본 연구에서는 B16F10 세포주9의 게놈에 LCMV 바이러스 당단백질(GP) 유전자 서열을 CRISPR/Cas9 매개 삽입하여 생성된 B16F10-GP 세포23,24의 결절내 주입을 통해 murine LN 전이성 모델을 확립했습니다. 그런 다음, 이들 마우스는 H-2Db GP33-41 에피토프25,26을 특이적으로 인식하는 형질전환 T 세포 수용체(TCR)를 보유하는 P14 세포로 옮겨졌고 LN 전이 동안 항원 특이적 CD8+ T 세포의 전신 및 국소 역학을 조사할 수 있었습니다. 당사의 실험 설계는 면역 반응, 특히 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제하는 LN 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 모델을 제공합니다. 이러한 결과는 mLN을 제거할지 또는 유지할지에 대한 임상 치료 옵션에 영향을 미치고 최대 치료 효과를 달성하기 위해 mLN을 조작하는 방법에 대한 새로운 빛을 비출 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
종양형성 과정에서 항원제시세포(APC)는 종양항원을 삼키고 TdLN으로 이동하여 CD8+ T 세포를 프라이밍합니다. 프라이밍 및 활성화 후, CD8+ T 세포는 TdLN을 떠나 종양에 침투하여 종양 세포를 죽인다10. 림프구에서 면역세포의 출구를 차단하는 TdLN 절제와 FTY720 투여를 통해 여러 연구에서 PD-1/PD-L1 체크포인트 요법의 효능을 보장하는 데 있어 TdLN의 중추적인 역할을 입?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 우수 젊은 학자를 위한 국가과학재단(82122028호에서 LX로), 중국국가자연과학재단(82173094호에서 LX), 중칭자연과학재단(2023NSCQ-BHX0087호에서 SW로)의 지원을 받았다.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referenzen
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