偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析
Summary
この論文では、偏光感受性2光子顕微鏡を使用して、ラベルフリーアミロイド上部構造-球晶体内の局所組織を特徴付ける方法について説明します。また、サンプルの調製と測定、必要なセットアップの組み立て、およびアミロイド線維の局所組織に関する情報を取得するためのデータの分析方法についても説明します。
Abstract
2光子励起は、1光子励起と比較して、光毒性が低く、組織への浸透が深く、高密度で密集したシステムでの効率的な操作が可能で、蛍光色素の光選択角度が小さくなるため、バイオイメージング実験に有益です。したがって、2光子蛍光顕微鏡(2PFM)における偏光分析の導入により、線形光学プロセスに基づく標準的なイメージング法と比較して、サンプル中の分子組織をより正確に決定することができます。本研究では、分極感受性2PFM(ps-2PFM)と、複雑な生体構造であるアミロイド球状突起内の分子秩序の決定への応用に焦点を当てています。アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患は、タンパク質のミスフォールディングプロセスの障害によって形成されるアミロイドタンパク質凝集体を検出することで診断されることがよくあります。その構造を探ることは、その生成経路をよりよく理解し、その結果、より感度の高い診断方法の開発につながります。本論文では、ウシインスリン球状物質および球状アミロイド原性タンパク質凝集体内の局所線維秩序の決定に適応したps-2PFMについて紹介する。さらに、提案手法により、球晶石内部のフィブリルの三次元組織化を解像できることを証明した。
Introduction
過去数十年にわたり、タンパク質とその凝集体のバイオイメージングのための多数の蛍光顕微鏡技術が大幅に開発されてきましたが1、サンプル内の局所的な秩序を解明するために使用されたのはごくわずかです2,3。蛍光寿命イメージング顕微鏡4は、アミロイド上部構造-球晶石の本質的な構造不均一性を研究するために使用されました。さらに、球晶石のような複雑で高密度に充填された生体構造内の局所秩序の定量的決定は、分極に敏感な方法を使用して解決することができました3。しかし、UV-VIS波長を使用してin vivoで蛍光色素を励起すると、組織の光散乱が大きくなるため、表在組織浸透を伴う標準的な蛍光技術には限界があります5。さらに、このようなイメージングでは、特定の蛍光プローブを設計し、標的とする生体分子に結合する必要があることが多く、イメージングを行うために必要なコストと作業量が増加します。
最近、これらの問題に対処するために、私たちのチームは、偏光感受性二光子励起蛍光顕微鏡(ps-2PFM)を適応させ、生体構造のラベルフリーイメージングに用いることにした6,7。Ps-2PFMは、励起ビームの直線偏光方向に対する2光子蛍光強度の依存性の測定と、放出された蛍光の偏光の分析を可能にする8。この技術を実装するには、標準的な多光子顕微鏡セットアップ励起経路(図1)に、光の偏光面を制御するための半波長板を追加する必要があります。次に、2つのアバランシェフォトダイオードによって収集された信号から、励起レーザービームの偏光に対する2光子励起蛍光強度の依存性を示す極性グラフが作成され、蛍光偏光の2つの相互に垂直な成分が収集されます。
最後のステップは、ダイクロイックミラーや高開口対物レンズなどの光学素子が偏光に与える影響を考慮したデータ解析プロセスです。2光子プロセスの性質上、焦点面外の蛍光色素の2光子励起は確率的に制限されるため、この方法では角度光選択の低減と軸方向分解能の向上の両方が得られます。また、深部組織イメージング用の近赤外プローブ(NIR)のin vivoイメージングにも同様の手法をうまく実装できることが証明されました9。Ps-2PFMは、細胞膜10やDNA11,12の蛍光色素や、金ナノ粒子13などの生体系の非標準蛍光マーカーのイメージングに応用されている。しかし、これらすべての例において、生体分子の組織に関する情報は間接的に得られたものであり、蛍光色素と生体分子の間にあらかじめ定義された相互配向を必要とした。
最近の論文では、ps-2PFMを応用して、アミロイド上部構造の自家蛍光と、球状突起中のアミロイド線維に結合したアミロイド特異的色素であるチオフラビンTの蛍光の局所偏光を解析できることを示しました6。さらに、別の研究では、ps-2PFMを利用して、アミロイドスフェルライト内のアミロイド線維配向をサブミクロンサイズで検出できることを証明し、透過型電子顕微鏡(TEM)イメージングとの相関関係で確認しました7。この成果の達成は、i)1つまたは2つの光子で励起されたときに、球晶アミロイドの固有の自家蛍光が、450〜500nmの範囲にある発光最大値と標準的な蛍光色素に匹敵する2光子吸収断面積を示す14、ii)生体膜およびDNA構造を標識する色素のps-2PEFをどのように適用できるかを説明するために以前に紹介した数理モデルのおかげで可能になりました球状物質とそれらに結合した染料によって示される蛍光8,11,15。したがって、分析を進める前に、このトピック6に関する最初の論文の本文と補足情報の両方に説明されている必要な理論に目を通すことを強くお勧めします。ここでは、ウシインスリン球状突起のラベルフリーアミロイド構造解析にps-2PFM法を適用する方法のプロトコルを紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
偏光感受性2光子顕微鏡は、アミロイド上部構造内のフィブリルの局所的な秩序を研究するための貴重なツールであり、標準的な多光子セットアップを少し変更するだけで済みます。非線形光学現象を操作するため、1光子励起蛍光顕微鏡法と比較して、角度による光選択の低減と軸方向分解能の向上を達成できます。さらに、1光子励起蛍光顕微鏡技術と比較して、光散乱が少なく、光毒性が?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ポーランドの国立科学センターの資金提供を受けたSonata Bis 9プロジェクト(2019/34/E/ST5/00276)の支援を受けました。
Materials
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
Referenzen
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