在基因工程小鼠模型中识别、诊断和分级恶性周围神经鞘瘤
Summary
我们开发了一种方法来评估基因工程小鼠的神经系统肿瘤是否准确地概括了人类对应物的病理学。在这里，我们将这些组织学技术、定义的病理学标准和培养方法应用于 P 0-GGFβ3 小鼠模型中出现的神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤。
Abstract
常染色体显性遗传肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 患者通常会发展为丛状神经纤维瘤 （PN），随后转化为高度侵袭性恶性周围神经鞘瘤 （MPNST）。基因工程小鼠 （GEM） 模型的可用性将有助于了解 PN 转化为 MPNST 的过程，这些模型可以准确复制在 NF1 患者中看到的 PN-MPNST 进展。不幸的是，具有 Nf1 消融的 GEM 模型并不能完全概括这一过程。这导致我们开发了 P 0-GGFβ3 小鼠，这是一种 GEM 模型，其中雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1 （NRG1） 在雪旺细胞中的过表达导致 PN 的发展，这些 PN 会发展为高频的 MPNST。然而，为了确定 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤发生和肿瘤进展是否准确地模拟了 NF1 患者所观察到的过程，我们必须首先证明 P0-GGFβ3 周围神经鞘瘤的病理学概括了其人类对应物的病理学。
在这里，我们描述了使用 P 0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3 在 GEM 模型中准确诊断和分级周围神经系统肿瘤的专用方法;以Trp53+/-小鼠为例。我们描述了用于诊断 PN 和 MPNST 的组织学、免疫组化和组织化学方法，如何将这些肿瘤与模仿其病理学的其他肿瘤类型区分开来，以及如何对这些肿瘤进行分级。我们讨论了从 GEM MPNST 建立早期传代培养物，如何使用免疫细胞化学表征这些培养物，以及如何通过建立同种异体移植物来验证它们的致瘤性。总的来说，这些技术表征了GEM模型中出现的PN和MPNST的病理学，并将这些小鼠肿瘤的病理学与人类肿瘤进行了批判性比较。
Introduction
在过去的三十年中，许多实验室试图通过将人类癌症相关突变引入小鼠基因组或过表达在人类癌症中过度表达的基因产物来创建人类癌症的小鼠模型。由此产生的基因工程小鼠 （GEM） 模型可用于多种目的，例如确定新引入的基因组修饰启动肿瘤发生，识别导致肿瘤进展的其他随后发生的遗传或表观遗传变化，以及定义驱动肿瘤启动和进展的关键信号通路。与依赖于使用免疫缺陷小鼠的原位异种移植模型不同，GEM癌症模型具有功能齐全的免疫系统，因此可以更准确地模拟对候选治疗药物的反应。然而，当将 GEM 癌症模型用于此类目的时，研究人员必须确认对 GEM 肿瘤的观察与人类对应物相关。该验证应包括对 GEM 肿瘤病理学的彻底评估，并确定 GEM 肿瘤的病理特征是否概括了相应人类肿瘤类型的病理学。
肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病 （NF1） 是影响人类神经系统的最常见的遗传疾病，每 3,000-3,500 名活产婴儿中约有 1 名发生 1,2,3。患有 NF1 的个体在其皮肤（真皮神经纤维瘤）以及大神经和神经丛（丛状神经纤维瘤）中出现多个良性周围神经鞘瘤，称为神经纤维瘤。虽然真皮神经纤维瘤和丛状神经纤维瘤都会通过产生身体、行为和/或社会障碍而恶化患者的生活质量，但丛状神经纤维瘤 （PN） 尤其危险 4,5。这是因为 PN 经常转化为恶性周围神经鞘瘤 （MPNST），这是一种侵袭性梭形细胞肿瘤，存活率极低 1,2。在很大程度上，这种低生存率是因为目前用于治疗MPNST的放疗和化疗方案无效。然而，开发新的、更有效的疗法一直具有挑战性。这是因为，尽管 MPNST 在 NF1 患者中很常见，但它们仍然是罕见的肿瘤。因此，很难获得大量的人类肿瘤进行研究;招募足够多的 MPNST 患者进行临床试验也具有挑战性。为了克服这些局限性，已经生成了几种 GEM 模型，目的是进一步了解驱动神经纤维瘤发病机制和 PN-MPNST 进展的异常，并促进候选治疗药物的临床前试验。
NF1 患者在 NF1 基因的一个拷贝中具有失活突变。当剩余功能性 NF1 基因的失活突变发生在雪旺细胞谱系的细胞中时，就会触发神经纤维瘤的发病机制。然而，令人惊讶的是，当小鼠产生生殖系失活 Nf1 突变时，它们并没有发展为神经纤维瘤 6,7。随后的证明是，在所有其他细胞类型中，具有 Nf1 无效雪旺细胞和 Nf1 单倍体功能不全的小鼠 （Krox20-Cre;Nf1flox/- 小鼠）开发的丛状神经纤维瘤表明，神经纤维瘤发病机制需要减少其他细胞类型中 Nf1 基因的剂量8。即便如此，Krox20-Cre 中的丛状神经纤维瘤;Nf1flox/-小鼠没有发展成为MPNST，因此仅部分模仿了人类对应物的生物学。当 Nf1 突变与其他肿瘤抑制基因（如 Trp539 或 Cdkn2a10）的突变结合时，确实会发生 MPNST 发病机制，但这些 GEM 模型中的 MPNST 是从头或从生物潜力不确定的非典型神经纤维瘤 （ANNUBPs） 11,12 发展而来的，而不是来自先前存在的良性丛状神经纤维瘤（见13,14对这些模型以及其他模型的出色评论，这些模型在基因（如 Suz12 和 Pten15）中引入了额外的 MPNST 相关功能丧失突变）。
这些小鼠模型对于确定 NF1、TP53 和 CDKN2A 等基因在 NF1 相关周围神经系统肿瘤发病机制中的作用以及测试候选治疗药物的临床前试验非常宝贵。然而，我们对丛状神经纤维瘤发展为具有不确定生物学潜力的非典型神经纤维瘤性肿瘤 （ANNUBPs16） 然后发展为 MPNST 的过程仍然不完全了解。最近在理解这一过程方面取得了一些进展，最近的报告称，Nf1 和 Arf 缺失的小鼠会发展出 ANNUBP，这些 ANNUBP 会发展成为 MPNSTs11。然而，基于 Nf1 突变的小鼠模型完全概括了人类中观察到的丛状神经纤维瘤-MPNST 进展过程。此外，目前尚不清楚是否存在多种不同的途径导致MPNST的发展。鉴于此，上述 GEM 可能仅模拟导致神经纤维瘤-MPNST 进展和 MPNST 发病机制的几种不同途径的子集。MPNST也是零星发生的，一些零星的MPNST显然没有NF1突变17,18，这一事实强调了这一点。
尽管 Magollon-Lorenz 等人最近提出的建议对后一点提出了挑战，即至少一些缺乏 NF1 突变的散发性 MPNST 是黑色素瘤或不同类型的肉瘤19，但我们最近报道了一种散发的 MPNST 和一种源自该肿瘤的细胞系（2XSB 细胞）是 NF1 野生型20.在表征亲本肿瘤和 2XSB 细胞系的过程中，我们系统地排除了其他诊断可能性，包括黑色素瘤和在散发性恶性周围神经鞘瘤鉴别诊断中常规考虑的多种其他肉瘤类型20。此外，我们注意到 Magollon-Lorenz 等人承认，他们在他们研究的三种散发性 MPNST 细胞系中的发现不能推广到表明所有被鉴定为散发性 MPNST 的肿瘤都不是 MPNST。
为了构建神经纤维瘤和 MPNST 发病机制不一定依赖于特定肿瘤抑制基因突变的 GEM 模型，我们生成了转基因小鼠，其中有效的雪旺细胞有丝分裂原神经调节蛋白-1 （NRG1） 的过表达由雪旺细胞特异性髓鞘蛋白零 （P0） 启动子 （P 0-GGFβ3 小鼠） 驱动21.我们之前已经证明，人神经纤维瘤、MPNST 和 MPNST 细胞系表达几种 NRG1 亚型以及介导 NRG1 信号传导的 erbB 受体酪氨酸激酶（erbB2、erbB3 和 erbB4），并且这些 erbB 受体被组成型激活22。我们还证明，erbB 激酶的药理学抑制剂可有效抑制 MPNST 增殖22、存活23 和迁移24。与我们在人类中的观察结果一致，P 0-GGFβ3 小鼠发展为丛状神经纤维瘤25，其发展为高频率的 MPNST 21,25。我们已经表明，P 0-GGFβ3 MPNST 与人类对应物一样，通常会发生 Trp53 和 Cdkn2a 的突变，以及许多其他可能导致肿瘤发生的基因组异常25。在 P 0-GGFβ3 小鼠中产生的 MPNST 没有失活的 Nf1 突变。然而，使用遗传互补，我们发现 NRG1 主要通过由 Nf1 缺失改变的相同信号级联促进 P 0-GGFβ3 小鼠的肿瘤发生26;这一结论是基于我们的发现，即在存在 Trp53 单倍体功能不全的情况下，用 NRG1 过表达代替 Nf1 缺失 （P 0-GGFβ3;Trp53+/-小鼠）产生MPNST从头发育的动物，如顺式Nf1+/-所示;Trp53+/- 小鼠27.
为了获得这一和其他信息，证明 P 0-GGFβ3 小鼠准确地模拟了 NF1 患者中观察到的神经纤维瘤发病机制和神经纤维瘤-MPNST 进展的过程，我们开发了专门的方法来处理来自这些动物的组织，准确诊断它们的肿瘤，对这些小鼠中产生的 MPNST 进行分级，建立和表征早期传代 P0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3;Trp53+/- MPNST 培养并批判性地比较 P 0-GGFβ3 PN 和 MPNST 以及 P0-GGFβ3 的病理学;Trp53+/- MPNSTs与人类对应物的MPNST。其中许多方法可以推广到神经系统肿瘤的其他GEM模型。此外，其中一些方法更广泛地适用于在其他器官部位出现肿瘤的 GEM 模型。因此，我们在这里对这些方法进行了详细描述。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的组织学和生化方法为诊断和表征神经纤维瘤的GEM模型和MPNST发病机制提供了一个框架。多年来，我们发现这些方法对于评估 GEM 模型21、25、26 中出现的周围神经鞘瘤的病理学非常有用。然而，虽然这里概述的方案对于确定GEM模型中的肿瘤如何准确地概括其人类对应物的病理学很有用，但这些策略存在一些局限性，应?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（R01 NS048353和R01 NS109655）的资助。R01 NS109655-03S1 至 D.P.J.）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804 至 S.L.C.）和国防部（X81XWH-09-1-0086 和 W81XWH-12-1-0164 至 S.L.C.）。
Materials
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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