Summary

استخراج الحمض النووي للدياتوم من عينات المياه والأنسجة

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الشائعة المعدلة.

Abstract

اختبار الدياتوم هو وسيلة مساعدة أساسية في ممارسة الطب الشرعي لتحديد ما إذا كانت الجثة قد غرقت في الماء واستنتاج موقع الغرق. اختبار الدياتوم هو أيضا محتوى بحثي مهم في مجال البيئة والعوالق. تعد تقنية اختبار البيولوجيا الجزيئية للدياتوم ، والتي تركز على الحمض النووي للدياتوم ككائن بحثي أساسي ، طريقة جديدة لاختبار الدياتوم. استخراج الحمض النووي للدياتوم هو أساس الاختبار الجزيئي للدياتوم. في الوقت الحاضر ، تعتبر المجموعات المستخدمة بشكل شائع لاستخراج الحمض النووي للدياتوم باهظة الثمن ، مما يزيد من تكلفة إجراء البحوث ذات الصلة. قام مختبرنا بتحسين مجموعة الاستخراج السريع للحمض النووي لجينوم الدم الكامل العام وحصل على تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم بشكل مرض ، وبالتالي توفير حل بديل اقتصادي وبأسعار معقولة لاستخراج الحمض النووي يعتمد على الخرز الزجاجي للأبحاث ذات الصلة. يمكن أن يلبي الحمض النووي للدياتوم المستخرج باستخدام هذا البروتوكول العديد من التطبيقات النهائية ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسلسل.

Introduction

في ممارسة الطب الشرعي ، يعد تحديد ما إذا كانت الجثة التي تم العثور عليها في الماء تغرق أو ألقيت في الماء بعد الوفاة أمرا ضروريا للحل المناسب للقضية1. كما أنها واحدة من القضايا الصعبة التي تحتاج إلى حل عاجل في ممارسة الطبالشرعي 2. الدياتومات وفيرة في البيئة الطبيعية (خاصة في الماء)3,4. في عملية الغرق ، بسبب نقص الأكسجة والاستجابة للإجهاد ، سيكون لدى الناس حركات تنفس مكثفة ويستنشقون كمية كبيرة من سائل الغرق. لذلك ، تدخل الدياتومات الموجودة في الماء إلى الرئة بسائل الغرق ، ويمكن لبعض الدياتومات أن تدخل الدورة الدموية من خلال الحاجز السنخي الشعري وتنتشر إلى الأعضاء الداخلية مع تدفق الدم 5,6. يعد اكتشاف الدياتومات في الأنسجة والأعضاء الداخلية مثل الرئة والكبد ونخاع العظام دليلا قويا على الغرق قبل الموت 7,8. حاليا ، يعتمد اختبار الدياتوم الشرعي بشكل أساسي على طرق الاختبار المورفولوجية. بعد سلسلة من الهضم المسبق للأنسجة ، يتم إجراء التقديرات النوعية والكمية المورفولوجية للدياتومات غير المهضومة تحت المجهر. خلال هذه الفترة ، يجب استخدام الكواشف الخطرة وغير الصديقة للبيئة مثل حمض النيتريك. تستغرق هذه العملية وقتا طويلا وتتطلب من الباحثين أن يكون لديهم خبرة تصنيفية قوية وتجربة واسعة. كل هذا يجلب بعض التحديات لموظفي الطب الشرعي9. تقنية اختبار الحمض النووي للدياتوم هي تقنية جديدة لاختبار المشطورات تم تطويرها في السنوات الأخيرة10،11،12. تحقق هذه التقنية تحديد الأنواع من الدياتومات من خلال تحليل تكوين تسلسل الحمض النووي المحدد للدياتومات13,14. تقنية PCR وتكنولوجيا التسلسل هي طرق تقنية شائعة الاستخدام ، ولكن أساسها هو الاستخراج الناجح للحمض النووي من الدياتومات. ومع ذلك ، فإن الدياتومات لها بنية خاصة مختلفة عن الكائنات الحية الأخرى ، مما يجعل تقنيات استخراج الحمض النووي مختلفة أيضا.

يحتوي جدار الخلية في المشطورة على درجة عالية من السيليكات ، ومكونه الرئيسي هو ثاني أكسيد السيليكون15،16،17. جدار الخلية السيليسية صعب للغاية ، ويجب تدميره قبل استخراج الحمض النووي. غالبا ما يصعب استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي العادية مباشرة لاستخراج الحمض النووي للدياتوم لأنها لا تستطيع تدمير القشرة السيليسية للدياتومات18. لذلك ، فإن تدمير القشرة السيليسية للدياتومات هو أحد المشكلات التقنية الرئيسية التي يجب حلها في استخراج الحمض النووي للدياتوم.

في الوقت نفسه ، نظرا لأن عدد الدياتومات الموجودة في عينات أبحاث الطب الشرعي ، سواء كانت عينات مياه أو أعضاء وأنسجة الجثث الغارقة ، غالبا ما يكون محدودا ، فمن الضروري إثراء الدياتومات. جوهر التخصيب هو فصل المواد. أثناء محاولة جمع الدياتومات معا ، قلل من محتوى مكونات المواد الأخرى (المكونات المتداخلة). في أعمال الطب الشرعي ، غالبا ما تستخدم المختبرات طرق الطرد المركزي أو الإثراء بالترشيح الغشائي لفصل خلايا المشطورة19. ومع ذلك ، نظرا لعدم استخدام معدات ضخ الفراغ على نطاق واسع ، فإن طريقة التخصيب الغشائي لا تستخدم غالبا في مختبرات الطب الشرعي الأولية العادية. لذلك ، لا تزال طريقة الطرد المركزي شائعة تخصيب الدياتوم في مختبرات الطب الشرعي20.

يستخدم استخراج الحمض النووي من الدياتومات حاليا في المقام الأول في ممارسة الطب الشرعي ، وهناك قيود كبيرة على تطبيقه. في الوقت الحاضر ، هناك عدد قليل من مجموعات استخراج الحمض النووي للدياتوم المستخدمة في علوم الطب الشرعي في السوق وهي باهظة الثمن بشكل عام21. توفر هذه المقالة طريقة محسنة لاستخراج الحمض النووي للدياتوم ، مما يجعل استخراج الحمض النووي للدياتوم بسيطا ومريحا وفعالا من حيث التكلفة. هذا يزيد من تطبيق اختبار البيولوجيا الجزيئية اللاحقة للدياتومات ويمكن أن يحل بشكل أفضل المشاكل المتعلقة بالغرق في الطب الشرعي من خلال اختبار الدياتوم. هذه الطريقة تكسر جدران الخلايا السيليسية للدياتومات عن طريق إضافة حبات زجاجية وتحديد وقت مناسب للدوامة. بهذه الطريقة ، يقوم البروتيناز K ومحلول الربط بتحليل الخلايا بسرعة وتعطيل الإنزيمات المختلفة في الخلايا. يتم امتصاص الحمض النووي الجينومي في غشاء المصفوفة في عمود الامتزاز وأخيرا يتم استخلاصه بواسطة محلول الشطف. تعمل مجموعة استخراج جينات الدم الكاملة المحسنة هذه على تحسين تأثير استخراج الحمض النووي للدياتوم لمجموعة الدم في مواد فحص الطب الشرعي ، وتقلل من تكلفة استخراج الحمض النووي للدياتوم في ممارسة الطب الشرعي ، ويمكن تطبيقها بشكل أفضل على أبحاث الطب الشرعي الشعبية.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة هاينان الطبية. لا تعتبر عينات الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة دراسات تشمل أشخاصا. تم الحصول على هذه العينات لغرض التشخيص المرضي الشرعي ، وتم استخدام الباقي لاستخراج الحمض النووي للدياتوم في هذه التجربة. لا يمكن للباحثين تحديد ال…

Representative Results

نظرا لأن محلول الحمض النووي المستخرج بواسطة طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة حاليا يحتوي على جميع مكونات الحمض النووي من مصادر مختلفة في العينة ، فإن الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بواسطة هذا البروتوكول لم يكن استثناء. لذلك ، لم يكن محلول الحمض النووي مجرد محلول للحمض النووي الجيني…

Discussion

خلايا المشطورة محمية بجدران الخلايا السيليسية الصلبة17 ، ويجب تدمير هذا الهيكل لاستخراج الحمض النووي للدياتوم. المجموعات العادية لا تدمر بسهولة القشرة السيليسية للدياتومات ؛ وبالتالي من الصعب استخراج الحمض النووي للدياتوم21 بنجاح. قام مختبرنا بتحسين مجموعة است?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82060341،81560304) ومشروع البحث العلمي لمنصة الابتكار الأكاديمي في مقاطعة هاينان (YSPTZX202134).

Materials

Binding Buffer BioTeke B010006022 rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR Mix Monad 00007547-120506 qPCR Mix
D2000 DNA ladder Real-Times(Beijing) Biotechnology RTM415 Measure the position of electrophoretic bands
D512 Taihe Biotechnology TW21109196 forword primer
D978 Taihe Biotechnology TW21109197 reverse primer
Elution buffer BioTeke B010006022 A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass bead Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)  70181000 Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption column BioTeke B2008006022 Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal Buffer BioTeke B010006022 Removal of Inhibitors in DNA Extraction
Isopropanol BioTeke B010006022 Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini Mixer Miulab MUC881206 oscillatory action
Proteinase K BioTeke B010006022 Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRM Qiagen R1116175 real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-Centrifuge Scilogex 9013001121 centrifuge
Tanon 3500R Gel Imager Tanon 16T5553R-455 gel imaging
Taq Mix Pro Monad 00007808-140534 PCR Mix
Thermo Cycler Zhuhai Hema VRB020A ordinary PCR
Wash Buffer BioTeke B010006022 Remove impurities such as cell metabolites

Referenzen

  1. Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
  2. Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
  3. Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
  4. Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
  5. Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
  6. Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
  7. Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
  8. Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
  9. Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
  10. Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
  11. Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
  12. Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
  13. Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
  14. Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
  15. Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
  16. Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
  17. Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
  18. Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
  19. Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
  20. Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
  21. Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
  22. Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
  23. Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
  24. Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
  25. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  26. Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
  27. Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
  28. Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
  29. Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
  30. Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
  31. Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
  32. Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
  33. Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Zhou, Y., Wang, B., Cai, J., Xu, Y., Qin, X., Ha, S., Cong, B., Chen, J., Deng, J. Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues. J. Vis. Exp. (201), e65792, doi:10.3791/65792 (2023).

View Video