نقدم هنا بروتوكولا لدراسة معدل بدء موت الخلايا المبرمج عن طريق التصوير المستمر للأوراق الملقحة بعد تحريض موت الخلية.
المقاومة الممنوحة للاستجابة شديدة الحساسية (HR) هي استجابة دفاعية فعالة يمكن تحديدها بواسطة جينات المقاومة N . يتجلى HR على أنه تشكيل مناطق موت الخلايا على الأوراق الملقحة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لدراسة معدل بدء موت الخلية عن طريق تصوير الأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية باستخدام المجهر الرقمي. يتيح المجهر الرقمي عملية تصوير مستمرة في الفترات المرغوبة ، مما يسمح بتحديد دقيق لمعدل بدء موت الخلايا حتى دقائق بالضبط ، بدلا من الساعات في الطرق التقليدية. التصوير باستخدام المجهر الرقمي مستقل أيضا عن الضوء وبالتالي يمكن استخدامه أثناء النهار والليل دون الإخلال بإيقاع الساعة البيولوجية للنبات. يمكن دراسة الأنظمة المرضية المختلفة التي تؤدي إلى تطور موت الخلايا المبرمج باستخدام هذا البروتوكول مع تعديلات طفيفة. بشكل عام ، يسمح البروتوكول بتحديد بسيط ودقيق وغير مكلف لمعدل بدء موت الخلايا.
البطاطا هي واحدة من المحاصيل الغذائية الأكثر زراعة على نطاق واسع في العالم، وتحتل المرتبة الرابعة بعد الأرز والقمح والذرة. ومع ذلك، يمكن أن يتأثر إنتاج البطاطا بشدة بفيروس البطاطا Y (PVY)، الذي يعتبر حاليا أهم مسببات الأمراض الفيروسية 1,2. في نباتات البطاطس السيرة الذاتية. Rywal ، عدة سلالات من PVY (بما في ذلك سلالة PVY N-Wilga) تؤدي إلى استجابة شديدة الحساسية (HR) – مقاومة ، حيث يظهر تقييد العامل الممرض لموقع العدوى على شكل آفات نخرية على الأوراق الملقحة3. في هذا النظام المرضي ، يتم التوسط في HR بواسطة جين مقاومة Ny-1 ، والذي يعتمد على درجة الحرارة ، حيث أن النباتات التي تنمو في درجات حرارة منخفضة تتطور بكفاءة إلى آفات نخرية ، بينما في النباتات التي تنمو بشكل أساسي عند درجة حرارة مرتفعة (28 درجة مئوية) ، يظهر إجهاض المقاومة على أنه نقص في تكوين الآفة وانتشار الفيروس الجهازي 3,4. عندما يتم نقل النباتات إلى درجة حرارة منخفضة (22 درجة مئوية) ، يبدأ موت الخلايا ، والذي يمكن استغلاله لمتابعة معدل بدء موت الخلية عن طريق تصوير الأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية.
يوضح هذا البروتوكول طريقة بسيطة لتحديد معدل بدء موت الخلايا باستخدام المجهر الرقمي. من خلال تصوير الأوراق الملقحة بعد نقل النبات من 28 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية ، يتيح المجهر الرقمي المراقبة المستمرة للورقة في الفترات المرغوبة. على عكس استخدام الطرق الأخرى (على سبيل المثال ، الفحص المجهري متحد البؤر أو مراقبة تكوين الآفة بالعين المجردة) ، فإن هذا يسمح بتحديد الوقت الدقيق لتشكيل الآفة وبالتالي معدل بدء موت الخلية حتى دقائق بالضبط ، بدلا من ساعات في الطرق المذكورة أعلاه 5,6. استخدام المجهر الرقمي مستقل أيضا عن الضوء وبالتالي يمكن استخدامه أثناء النهار والليل. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد المكونات المشاركة في بدء موت الخلايا أو لتحديد تأثيرات المكونات المختلفة على معدل بدء موت الخلايا إذا كانت النباتات المستخدمة محورة وراثيا ولديها مستويات متغيرة من المكونات ذات الأهمية.
يسمح البروتوكول الموضح للمستخدم بتحديد معدل بدء موت الخلية بدقة عن طريق التصوير المستمر للأوراق الملقحة في الوقت بين بدء موت الخلية وظهور موت الخلية باستخدام مجهر رقمي. على الرغم من وجود طرق عديدة لمراقبة حدوث الآفات والأمراض النباتية12،13،14،15 ، فإن هذا البروتوكول يقدم ميزة القياس المستقل عن الضوء دون الإخلال بإيقاع الساعة البيولوجية للنبات ، حيث يتم إيقاف تشغيل الضوء بين القياسات.
بعد التلقيح ، يجب أن تنمو النباتات عند 28 درجة مئوية لمدة 3 أيام. يعتمد جين مقاومة Ny-1 ، الذي يحفز استجابة شديدة الحساسية ، على درجة الحرارة ، وفي النباتات التي تزرع في درجات حرارة أعلى ، يؤدي إلى إجهاض المقاومة ، والذي يتجلى في نقص تكوين الآفة وانتشار الفيروس الجهازي3. بعد نقل النباتات إلى 22 درجة مئوية ، يبدأ موت الخلايا ، لذلك للحصول على نتائج دقيقة ، يجب أن تبدأ المراقبة باستخدام المجهر الرقمي في أقرب وقت ممكن بعد هذا النقل. خطوة أخرى حاسمة في إعداد النبات للتصوير هي تثبيت الورقة (الشكل 1D) ، حيث سيستمر النبات في النمو أثناء التصوير ، مما قد يؤدي إلى إبعاد الورقة المرصودة عن التركيز ، أو أن هذا الإعداد لن يعطي النتائج المرجوة.
إذا تم استخدام البروتوكول الموصوف على النباتات المحورة وراثيا ذات المكونات المتغيرة ذات الأهمية ، والتي يفترض أنها تشارك في بدء موت الخلايا ، فإن البروتوكول يمكن المستخدم من تحديد ما إذا كان المستوى المنخفض للمكون المدروس يؤثر على معدل بدء موت الخلية. من خلال ذلك ، يمكن تحديد المكونات المشاركة في بدء موت الخلايا في الأنظمة المرضية ، حيث يحدث موت الخلايا المبرمج ، باستخدام هذا البروتوكول. الطرق الأخرى لتحديد هذه المكونات هي ، على سبيل المثال ، التحليل النسخي مثل RNA-seq أو أشكال مختلفة من الفحص المجهري ، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاطويلا 16. تسمح الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول بتحديد سهل وغير مكلف للمكونات المشاركة في بدء موت الخلايا من خلال ملاحظة الاختلافات في معدلات بدء موت الخلايا بين النباتات المحورة وراثيا ومحطات التحكم. على النحو الأمثل ، في مثل هذا الإعداد ، يجب استخدام كاميرتين رقميتين ، حيث يجب تحليل النبات المعدل وراثيا بالتوازي مع مصنع التحكم في نفس التجربة.
في هذا البروتوكول ، تم استخدام سلالة PVY N-Wilga. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات أخرى من هذا الفيروس ، على سبيل المثال ، PVY (PVY-N605 (123) -GFP) 7 الموسومة ب GFP. علاوة على ذلك ، يمكن دراسة الأنظمة المرضية الأخرى ، والتي تؤدي إلى تطور موت الخلايا المبرمج باستخدام هذا البروتوكول مع تعديل طفيف.
The authors have nothing to disclose.
ونشكر باربرا ياكليتش على المساعدة التقنية. وقدمت الوكالة السلوفينية للبحوث والابتكار الدعم المالي لهذا البحث (التمويل الأساسي للبحوث رقم P4-0165 والمشروع Z4-3217: فك رموز الترابط بين الإشارات المتصلة بالاختزال في مقاومة البطاطا للفيروسات).
Alcohol burner | Mikro+Polo | SH-234002455 | For tweezers and scalpel sterilization |
Autoclave A-21 CAV | Kambi![]() |
N/A | |
Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | |
Carborundum powder | VWR Chemicals | 22505297 | |
DinoCapture 2.0 | Dino-Lite | Version 2.0 | software for digital microscope |
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope | AnMo Electronics Corporation | AM7915MZTL | |
Ethanol, 70% | Stella Tech | P94000 | For tweezers and scalpel sterilization |
Extraction bags | Bioreba | 420100 | |
Growth chamber FS-WI | Photon Systems Insturments | N/A | |
Hand homogenizer | Bioreba | 400010 | |
Hawita Special Substrate | HAWITA Gruppe | 2000000071701 | Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8) |
Hydrochloric acid (HCl) | Merck | 109057 | |
Label tape | Sigma | L8144-5EA | |
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0 | HP | Z2V77EA#BED | Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber |
Murashige and Skoog medium | Duchefa Biochemie | M02220100 | |
Na2HPO4 | Emsure | 1065860500 | |
NaH2PO4 | Emsure | 1064700250 | |
Pasteur pipette 0.5 mL | Brand | 21500209 | |
pH-meter | Mettler Toledo | ML1601 | |
Plastic boxes | Cvetlice Dornig | VCG10.5 | Radius = 10.5 cm |
Plastic pots | Lab Associates | DIS40003 | Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom) |
Saccharose | Kemika d.d. | 1800408 | |
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA) | Sigma-Aldeich | 228680 | Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent |
Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106462 | |
Sterile surgical blades | Braun | 4511733633 | |
Tweezers | Braun | BD033R |