Modelo de oclusión transitoria de la arteria cerebral media de accidente cerebrovascular
Summary
Este protocolo describe el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en ratones a través de la oclusión intraluminal de la arteria cerebral media. Además, se muestran ejemplos de evaluación de resultados mediante resonancia magnética y pruebas de comportamiento.
Abstract
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de muerte o discapacidad crónica en todo el mundo. Sin embargo, los tratamientos óptimos existentes se limitan a las terapias de reperfusión durante la fase aguda del ictus isquémico. Para obtener información sobre la fisiopatología del ictus y desarrollar enfoques terapéuticos innovadores, los modelos in vivo de ictus en roedores desempeñan un papel fundamental. La disponibilidad de animales modificados genéticamente ha impulsado especialmente el uso de ratones como modelos experimentales de ictus.
En los pacientes con accidente cerebrovascular, la oclusión de la arteria cerebral media (ACM) es una ocurrencia común. En consecuencia, el modelo experimental más prevalente es la oclusión intraluminal del ACM, una técnica mínimamente invasiva que no requiere craneectomía. Este procedimiento consiste en insertar un monofilamento a través de la arteria carótida externa (ECA) y hacerlo avanzar a través de la arteria carótida interna (ACI) hasta llegar al punto de ramificación de la ACM. Después de una oclusión arterial de 45 minutos, se retira el monofilamento para permitir la reperfusión. A lo largo del proceso, se monitoriza el flujo sanguíneo cerebral para confirmar la reducción durante la oclusión y la posterior recuperación tras la reperfusión. Los resultados neurológicos y tisulares se evalúan mediante pruebas conductuales y estudios de imágenes por resonancia magnética (IRM).
Introduction
El accidente cerebrovascular es una enfermedad devastadora que afecta aproximadamente a 15 millones de personas en todo el mundo anualmente, según la OMS. Alrededor de un tercio de los pacientes sucumben a la enfermedad, mientras que otro tercio experimenta una discapacidad permanente. El accidente cerebrovascular es una patología compleja que involucra varios tipos de células, como las células inmunitarias neurales y periféricas, la vasculatura y las respuestas sistémicas1. La intrincada red de reacciones desencadenadas por el accidente cerebrovascular a nivel de sistemas no se puede replicar actualmente utilizando modelos in vitro . Por lo tanto, los modelos animales experimentales son esenciales para profundizar en los mecanismos de la enfermedad y para desarrollar y probar nuevas terapias. Actualmente, la reperfusión tisular precoz es la única intervención aprobada, ya sea mediante trombólisis con activador tisular del plasminógeno (tPA) o trombectomía endovascular1.
Las oclusiones de la arteria cerebral media (ACM) son frecuentes en los pacientes con ictus. En consecuencia, inicialmente se desarrollaron modelos de roedores de oclusión transitoria de MCA (tMCAo) en ratas 2,3,4. Hoy en día, los ratones modificados genéticamente son los animales más utilizados en modelos experimentales de ictus. En este estudio, describimos un modelo mínimamente invasivo de tMCAo intraluminal en ratones. El abordaje se realiza a través de la arteria carótida a nivel del cuello, sin craniectomía.
La duración del período de oclusión es un factor crítico que determina la extensión de la lesión isquémica. Incluso las oclusiones cortas de 10 minutos pueden causar muerte neuronal selectiva sin un infarto aparente, mientras que las oclusiones más largas, que suelen durar de 30 a 60 minutos, dan lugar a algún grado de infarto cerebral. A diferencia de las ramas proximal y distal de la ACM que irrigan la corteza y tienen colaterales, las arterias lenticulo-estriadas que suministran sangre al cuerpo estriado carecen de colaterales5. Como consecuencia, hay una mayor reducción del flujo sanguíneo en el cuerpo estriado que en la corteza después de la tMCAo. Así, las oclusiones de 30 min o menos afectan generalmente al cuerpo estriado pero no a la corteza, mientras que las oclusiones más largas, a partir de los 45 min, suelen generar una lesión isquémica en todo el territorio de la ACM, incluyendo el cuerpo estriado y la corteza dorsolateral.
Para garantizar el bienestar de los ratones, administramos analgésicos antes del procedimiento y utilizamos anestesia durante la cirugía. Sin embargo, la anestesia puede potencialmente introducir alteraciones artificiales en la fisiología del ratón y afectar algunas medidas de resultado6. La intervención quirúrgica, cuando es realizada por personal experimentado, suele durar unos 15 minutos para inducir la ACMo. Posteriormente, el tiempo total bajo anestesia depende del período de oclusión. Para los experimentos en los que minimizar la anestesia es crucial, un paso alternativo en el procedimiento implica suspender la anestesia durante el período de oclusión y limitarla solo a los pasos quirúrgicos para insertar y retirar el filamento que ocluye el MCA. Este abordaje reduce la duración de la anestesia y minimiza sus potenciales efectos artefactuales sobre el modelo experimental 7,8. Por lo tanto, el método de inducción de isquemia focal transitoria se presenta por oclusión intraluminal de la ACM con dos variantes: con el ratón anestesiado durante todo el período de oclusión o con el ratón despierto durante este período. En cualquier caso, se debe realizar una cirugía simulada en paralelo a la intervención realizada en los ratones isquémicos. Además, se proporcionan datos sobre la evaluación de los resultados medidos por pruebas de comportamiento y resonancia magnética en varios momentos después de la reperfusión. Por último, se discuten los principales factores a tener en cuenta a la hora de implementar el procedimiento experimental.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento intraluminal de tMCAo es el modelo más utilizado de isquemia cerebral focal con reperfusión en investigación básica. Actualmente, los ratones son el modelo animal preferido debido a la disponibilidad de cepas modificadas genéticamente. Sin embargo, es esencial reconocer que los ratones modificados genéticamente y sus antecedentes genéticos pueden afectar la vascularización cerebral. La presencia de circulación colateral y anastomosis entre diferentes territorios arteriales puede influir signific…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estudio financiado por la subvención PID2020-113202RB-I00 financiada por el Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Una manera de hacer Europa”. NCC y MAR tenían becas predoctorales (PRE2021-099481 y PRE2018-085737, respectivamente) financiadas por MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 y por “Fondo Social Europeo (FSE) Invertir en tu futuro”. Agradecemos a Francisca Ruiz-Jaén y Leonardo Márquez-Kisinousky por su apoyo técnico. Agradecemos el apoyo del centro de resonancia magnética del Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). El Programa Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) de la Generalitat de Catalunya apoya al IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
Referenzen
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