Disociación mecánica de tejidos para el análisis de células individuales mediante un dispositivo motorizado
Summary
Se proporciona un protocolo general para la disociación mecánica enzimática y semiautomatizada combinada de tejidos para generar suspensiones unicelulares para análisis posteriores, como la citometría de flujo. Se incluyen instrucciones para la fabricación, montaje y operación del dispositivo mecánico de bajo costo desarrollado para este protocolo.
Abstract
Ser capaz de aislar y preparar células individuales para el análisis de muestras de tejido se ha convertido rápidamente en algo crucial para los nuevos descubrimientos e investigaciones biomédicas. Los protocolos manuales para el aislamiento de una sola célula consumen mucho tiempo y son propensos a la variabilidad del usuario. Los protocolos mecánicos automatizados pueden reducir el tiempo de procesamiento y la variabilidad de las muestras, pero no son fácilmente accesibles ni rentables en entornos de investigación con menos recursos. El dispositivo descrito aquí fue diseñado para la disociación semiautomatizada de tejidos utilizando materiales disponibles comercialmente como una alternativa de bajo costo para los laboratorios académicos. Se han proporcionado instrucciones para fabricar, ensamblar y operar el diseño del dispositivo. El protocolo de disociación produce de forma fiable suspensiones unicelulares con rendimientos celulares y viabilidad de muestras comparables a las preparaciones manuales en múltiples tejidos de ratón. El protocolo proporciona la capacidad de procesar hasta 12 muestras de tejido simultáneamente por dispositivo, lo que hace que los estudios que requieren grandes tamaños de muestra sean más manejables. El software que lo acompaña también permite personalizar el protocolo del dispositivo para adaptarse a los diferentes tejidos y restricciones experimentales.
Introduction
El análisis de una sola célula se ha convertido rápidamente en crucial para los nuevos descubrimientos biomédicos, ya sea para aplicaciones como la citometría de flujo, la identificación de diferentes tipos de células, la secuenciación de una sola célula o para la identificación de variaciones genómicas o transcriptómicasentre células. La realización de este tipo de aislamientos celulares a partir de tejidos de interés requiere picar los tejidos disecados y empujarlos a través de un fino filtro celular para filtrar el tejido conectivo de las células deseadas (Figura 1A). El aislamiento de tipos de células adherentes, como células dendríticas o macrófagos, o células de tejidos particularmente fibrosos, requiere pasos adicionales de separación mecánica o enzimática 2,3,4. Este proceso generalmente se realiza manualmente, lo que lo hace muy lento y propenso a la variabilidad del usuario al evaluar el rendimiento celular y la viabilidad de la muestra. Por lo tanto, es crucial introducir opciones personalizables para la disociación automatizada de tejidos. Si bien se han hecho algunos intentos de diseñar tales sistemas, las opciones existentes no siempre son fácilmente accesibles, particularmente en laboratorios académicos y entornos de bajos recursos, en gran parte debido a la naturaleza prohibitiva de estos dispositivos5. Además, estos dispositivos no siempre son personalizables a las necesidades individuales de un grupo de investigación6.
Aquí, se diseñó un dispositivo disociador de tejidos para automatizar la digestión de tejidos enteros o trozos de tejido en suspensiones unicelulares con la ayuda de enzimas digestivas y disrupciones mecánicas. Este dispositivo se puede ensamblar fácilmente en el laboratorio, colocar en cámaras de calentamiento o enfriamiento para regular la temperatura, personalizar para el número requerido de tejidos a disociar y programar con los protocolos de disociación deseados. El uso generalizado de este dispositivo podría mejorar significativamente la reproducibilidad de los protocolos de extracción celular y proporcionar una alternativa que ahorra tiempo a la disociación manual.
El diseño permite la digestión simultánea de hasta 12 tejidos a través de un proceso automatizado. El dispositivo está compuesto por 12 motores individuales cableados en paralelo y alimentados por un enchufe de pared estándar a través de un adaptador de CA/CC con un dial de voltaje ajustable para controlar la rotación/velocidad de los motores. Los motores giran un perno hexagonal que encaja perfectamente en la parte superior de los tubos C. Los tubos C se mantienen en su lugar mediante una tensión hacia abajo en una placa acrílica que se engancha a cada lado de la placa superior donde se aseguran los motores (Figura 1B). Debido a que los motores están conectados en paralelo, su velocidad a cualquier voltaje dado no debería variar mucho, pero la carga (la cantidad de tubos C montados en el dispositivo) afectará la velocidad incluso cuando el voltaje se mantenga constante. Para medir las rotaciones por minuto (rpm), se ha incorporado un tacómetro mediante un sensor de efecto Hall y un imán fijo en uno de los ejes del motor (Figura complementaria 1). Los archivos CAD para la construcción de matrices de motores se proporcionan en el Archivo de codificación suplementario 1. También se incluye un interruptor programable para invertir la dirección de rotación invirtiendo las cargas positivas/negativas entregadas a los motores. Todas estas características se integran mediante software codificado (software Arduino IDE, consulte la Tabla de materiales) en un Arduino Nano (Archivo de codificación suplementario 2). Usando botones conectados y un panel LCD (Figura complementaria 2), es posible crear y ejecutar protocolos guardados y personalizados, invertir automáticamente la dirección de rotación en momentos específicos de un protocolo, ajustar la velocidad usando el voltaje (Figura complementaria 3) y mostrar la velocidad actual del motor y el tiempo restante para completar un protocolo programado (Figura complementaria 4).
Para el presente estudio, se prepararon suspensiones unicelulares utilizando tanto la disociación de tejido mecánico-enzimático con este dispositivo como la disociación manual-enzimática de tejido para determinar las diferencias, si las hubiera, en las células recuperadas para aplicaciones posteriores. Las preparaciones celulares se evaluaron en función de los rendimientos celulares totales por tejido y el porcentaje de viabilidad celular. Se utilizó la citometría de flujo para comparar las posibles diferencias en la expresión de marcadores de superficie. Los datos fueron analizados mediante software de graficación y análisis estadístico. Se utilizaron pruebas t de Welch no apareadas para comparar pares de muestras o grupos, con tamaños de muestra n > 4 ratones que representaban 2 experimentos replicados. Las instrucciones detalladas para la fabricación y el montaje de este dispositivo se pueden encontrar en el Archivo Complementario 1. Los materiales necesarios para este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este dispositivo fue diseñado para un fácil ensamblaje en el entorno de investigación para proporcionar suspensiones unicelulares a partir de tejidos enteros para su posterior análisis de células individuales. Las características, aunque básicas, son suficientes para satisfacer las necesidades de los investigadores en entornos académicos y más allá. Un beneficio clave del uso de este dispositivo es su potencial para mejorar la preparación de suspensiones unicelulares al reducir la variabilidad. Además, la cap…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se recibieron fondos del Departamento de Bioingeniería de Fischell (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) y American Lung Association (KM). Los autores desean agradecer a Michele Kaluzienski por su ayuda con la edición.
Materials
| ¼ inch acrylic sheet 12" x 24" | Acrylic Mega Store | N/A | |
| ½ inch acrylic sheet 12" x 12" | SimbaLux | SL-AS13-12×12 | |
| 12 G stainless steel wire (for tension arms) | Everbilt | 1000847413 | |
| 16 G electrical wire (stranded) | Best Connections | N/A | |
| 2 x 3 mm magnet | SU-CRO0587 | N/A | |
| 2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors) | AEDIKO | AE06233 | |
| 37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12 | Greartisan | N/A | Rated Torque: 2.2 Kg.cm Reduction Ratio: 1:22 Rated Current: 0.1 A D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24" x 0.55") (D x L) Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46" x 0.98") (D x L) Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43" x 1.31") (D x L) Mounting Hole Size: M3 (not included) |
| AC/C Power Adapter with variable voltage controller (5 Amps, 3-12 volts) | Mo-gu | J19091-2-MG-US | |
| AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer | Walfront | 1A | (power adapter for powering Arduino Nano) |
| Arduino Nano (Lafvin) | LAFVIN | 8541582500 | |
| Buttons | Awpeye | Push-button | |
| C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | ||
| Collagenase 4 | Worthington | CLS4 LS004188 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse | Roche | 11284932001 | |
| Double sided foam tape | SANKA | N/A | |
| Double Sided prototyping circuit board | deyue | N/A | |
| EDTA | Sigma- Aldrich | E7889 | |
| Electrical solder and soldering iron | LDK | 1002P | |
| Electrical Tape | 3M | 03429NA | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 16140089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Graphpad Prism | GraphPad, La Jolla, CA | Graphing and statistical analysis software | |
| Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches | SunFounder | 43237-2 | |
| Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12 | Uxcell | N/A | |
| Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12 | FAS | N/A | |
| Jumper wires (for Arduino Nano) | ELEGOO | EL-CP-004 | |
| LCD screen | JANSANE | N/A | |
| M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12 | Shenzhen Baishichuangyou Technology co.Ltd |
310luosditaozhuang | |
| M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36 | Still Awake | a52400001 | |
| Quick disconnect terminal connectors | IEUYO | 22010064 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling | 46232 | |
| Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano 12" x 24" | Shenzhen Weiyapuhua Technology |
60-026-3 |
Referenzen
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- Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
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