骨粗鬆症マウスモデルにおける海綿骨マイクロアーキテクチャ評価
Summary
このプロトコルはヘマトキシリンEosin (HE)の汚損およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)の技術の結合によって骨粗しょう症のマウス モデルの骨のmicroarchitectureの量的な評価のための経済的で、有効な方法を示す。
Abstract
骨の微細構造とは、顕微鏡レベルでの骨組織の配置と質を指します。骨格の骨微細構造を理解することは、骨粗鬆症の病態生理学への洞察を得て、その治療を改善するために重要です。ただし、骨サンプルの取り扱いは、硬くて密度の高い特性のために複雑になる可能性があります。第二に、専用のソフトウェアが画像処理と分析を困難にします。このプロトコルでは、海綿骨の微細構造解析のための費用対効果が高く使いやすいソリューションを紹介します。詳細な手順と注意事項が記載されています。マイクロCTは、海綿骨構造の高解像度画像を提供する非破壊3次元(3D)イメージング技術です。骨質を客観的かつ定量的に評価できるため、骨質評価のゴールドスタンダード手法として広く認められています。しかし、組織球計測は、骨標本の2次元(2D)評価と3D評価の間のギャップを埋める重要な細胞レベルのパラメータを提供するため、依然として不可欠です。組織学的手法に関しては、骨組織を脱灰してから、従来のパラフィン包埋を行うことを選択しました。要約すると、これら2つの方法を組み合わせることで、骨の微細構造に関するより包括的で正確な情報を得ることができます。
Introduction
骨粗鬆症は、特に高齢者に蔓延する代謝性骨疾患であり、脆弱性骨折のリスク増加と関連しています。中国で骨粗鬆症が蔓延するにつれて1、小動物の骨構造を研究する需要が高まるでしょう2,3。骨量減少を測定する以前の方法は、2次元二重エネルギーX線吸収測定の結果に依存しています。しかし、これでは骨格強度の重要な要素である海綿骨の構造微細構造の変化を捉えることはできません4。骨の微細構造は、その強度、剛性、および骨折抵抗に影響を与えます。正常状態と病理状態の骨マイクロアーキテクチャを比較することにより、骨粗鬆症によって引き起こされる骨組織の形態、構造、および機能の変化を特定できます。この情報は、骨粗鬆症の発症と他の疾患との関連を理解するのに役立ちます。
マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)イメージングは、骨の体積分率、厚さ、分離などの骨構造と密度パラメータに関する正確で包括的なデータを提供できる、骨形態評価のための最近の一般的な技術となっています5,6。同時に、マイクロCTの結果は、解析ソフトウェア7によって影響を受ける可能性がある。画像の取得、評価、およびレポート作成のさまざまな方法は、さまざまな市販のマイクロCTシステムで使用されています。この不一致により、異なる研究によって報告された結果を比較して解釈することが困難になります5。また、現在のところ、骨格系の細胞レベルのパラメータに関する情報を研究者に提供する上で、骨組織形成術に取って代わることはできません8。一方、組織学的手法により、骨の顕微鏡的形態を直接観察および測定することができます。ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色は、細胞や組織の一般的な構造を可視化するために組織学で使用される一般的な染色技術です。これは、骨組織とそのマイクロアーキテクチャの存在を特定するために使用されます。
本稿では、骨粗鬆症マウスモデルにおいて、マイクロCTと組織スライス技術(ヘマトキシリン-エオシン[HE]染色)を組み合わせて骨組織画像を収集し、海綿骨の定量的解析を行い、骨粗鬆症マウスモデルにおける骨微細構造の変化を評価します。
Protocol
動物プロトコルは、成都中医薬大学の動物倫理委員会によって承認されています(記録番号:2020-34)。雌のC57BL/6Jマウス(12週齢、n=14)を、偽手術群(偽群、n=7)とモデル群(OVX群、n=7)の2群に無作為に分けた。動物は商業供給業者から購入しました( 材料表を参照)。すべてのマウスを22〜26°C、湿度45%〜55%の個別のケージに入れ、新しい環境に1週間適応させ、水と餌を自由に摂取できるよ?…
Representative Results
マイクロCT解析両群のマウスで線維柱帯の微細構造パラメータを測定し、その平均値とSDを表1に報告した。各グループ内のいくつかのパラメータ(すなわち、総組織体積に対する骨体積の比率、海綿の厚さ、線維柱帯の分離)の分布を図3に示します。 これらの結果は、マイクロCTから推…
Discussion
骨粗鬆症は頻繁な骨折につながる可能性があり、費用がかかり、痛み、障害、さらには死を引き起こす可能性があり、患者の生活の質に深刻な影響を与える可能性があります20。何年にもわたって、卵巣摘出術モデルは骨粗鬆症を研究するための標準的な方法の1つとして認識されてきました21。骨粗鬆症の最も一般的な前臨床動物モデルは、卵巣摘出術(OVX)…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、四川省中医薬管理局(2021YJ0175)および成都中医薬大学臨床医学院(LCYJSKT2023-11)の大学院研究革新プロジェクトの支援を受けました。
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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Diesen Artikel zitieren
Li, J., Hu, Y., You, H., Li, R., Ran, Q., Ouyang, T., Huang, Y. Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model. J. Vis. Exp. (199), e65880, doi:10.3791/65880 (2023).