Trasplante de tráquea intrapulmonar murina: un modelo para investigar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias después de un trasplante de pulmón
Summary
El modelo de trasplante traqueal intrapulmonar murino (IPTT, por sus siglas en inglés) es valioso para estudiar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias (OAD, por sus siglas en inglés) después del trasplante de pulmón. Ofrece información sobre el comportamiento inmunológico y angiogénico específico del pulmón en la obliteración de las vías respiratorias después del alotrasplante con alta reproducibilidad. A continuación, describimos el procedimiento IPTT y sus resultados esperados.
Abstract
El trasplante traqueal intrapulmonar murino (IPTT) se utiliza como modelo de enfermedad obliterante de las vías respiratorias (DAO) después del trasplante pulmonar. Inicialmente reportado por nuestro equipo, este modelo ha ganado uso en el estudio de la OAD debido a su alta reproducibilidad técnica e idoneidad para investigar comportamientos inmunológicos e intervenciones terapéuticas.
En el modelo IPTT, un injerto traqueal de roedor se inserta directamente en el pulmón del receptor a través de la pleura. Este modelo es distinto del modelo de trasplante traqueal heterotópico (HTT), en el que los injertos se trasplantan en sitios subcutáneos u omentales, y del modelo de trasplante traqueal ortotópico (OTT) en el que la tráquea del donante reemplaza la tráquea del receptor.
La implementación exitosa del modelo IPTT requiere habilidades anestésicas y quirúrgicas avanzadas. Las habilidades anestésicas incluyen la intubación endotraqueal del receptor, el establecimiento de parámetros ventilatorios apropiados y la extubación programada adecuadamente después de la recuperación de la anestesia. Las habilidades quirúrgicas son esenciales para la colocación precisa del injerto dentro del pulmón y para garantizar un sellado eficaz de la pleura visceral para evitar fugas de aire y hemorragias. En general, el proceso de aprendizaje dura aproximadamente 2 meses.
A diferencia de los modelos HTT y OTT, en el modelo IPTT, la vía aérea del aloinjerto desarrolla obliteración de la vía aérea en el microambiente pulmonar relevante. Esto permite a los investigadores estudiar los procesos inmunológicos y angiogénicos específicos de los pulmones implicados en la obliteración de las vías respiratorias después del trasplante de pulmón. Además, este modelo también es único en el sentido de que exhibe órganos linfoides terciarios (TLO), que también se observan en aloinjertos pulmonares humanos. Los TLO están compuestos por poblaciones de células T y B y se caracterizan por la presencia de vénulas endoteliales altas que dirigen el reclutamiento de células inmunitarias; por lo tanto, es probable que desempeñen un papel crucial en la aceptación y el rechazo del injerto. Concluimos que el modelo IPTT es una herramienta útil para el estudio de las vías inmunes y profibróticas intrapulmonares implicadas en el desarrollo de la obliteración de la vía aérea en el aloinjerto de trasplante pulmonar.
Introduction
El trasplante pulmonar se ha establecido como un tratamiento eficaz para pacientes con enfermedades respiratorias terminales. Sin embargo, la mediana de la tasa de supervivencia de los receptores de trasplante de pulmón humano es de solo aproximadamente 6 años, siendo el desarrollo de bronquiolitis obliterante (OB), un tipo de enfermedad obstructiva de las vías respiratorias (OAD), una de las principales causas de muerte después del primer año después del trasplante1.
Se han utilizado varios modelos animales para investigar el mecanismo subyacente a la OAD. Uno de estos modelos es el modelo de trasplante traqueal heterotópico (HTT)2. En este modelo, los injertos traqueales se implantan en el tejido subcutáneo u epiplón del receptor. Se produce la pérdida de células epiteliales del injerto traqueal inducida por isquemia, seguida de infiltración de linfocitos aloactivos y apoptosis de las células epiteliales del donante. Los fibroblastos y miofibroblastos migran alrededor de la tráquea, produciendo una matriz extracelular. Finalmente, se produce la obliteración fibrosa completa de la luz de las vías respiratorias. El modelo HTT es técnicamente simple, proporciona un entorno in vivo y ofrece una alta reproducibilidad.
Otro modelo para el estudio de la DAO es el modelo de trasplante traqueal ortotópico de rata (OTT), en el que los injertos traqueales se interponen en la tráquea del receptor para mantener la ventilación fisiológica3. En este modelo, la depleción inducida por isquemia de las células epiteliales del donante da lugar a su sustitución por células epiteliales receptoras dentro de la tráquea, formando una vía aérea sin obstrucciones acompañada de fibrosis moderada. Aunque estos modelos han contribuido a la comprensión de la obliteración de la vía aérea después del trasplante pulmonar, tienen limitaciones en cuanto a la recapitulación del microambiente del parénquima pulmonar.
Nuestro grupo de investigación introdujo el modelo de trasplante traqueal intrapulmonar en ratas (IPTT), en el que se implantan injertos traqueales en el pulmón receptor4 (Figura 1). El modelo IPTT exhibe obliteración fibrosa de la luz de las vías respiratorias que ocurre dentro del microambiente pulmonar. Además, se ha aplicado con éxito a ratones que son técnicamente más desafiantes que el IPTTde ratas 5,6,7,8,9,10. Esta adaptación del modelo murino de IPTT nos permitió profundizar en los intrincados detalles del entorno inmunológico pulmonar de la OAD después del trasplante pulmonar con ratones transgénicos.
El modelo IPTT posee algunas características únicas. Una de ellas es la neoangiogénesis, que es facilitada por la circulación pulmonar y desempeña un papel crucial en la obliteración de la vía aérea 4,10. Además, el modelo IPTT exhibe agregados linfoides, algunos de los cuales tienen vénulas endoteliales elevadas que expresan la dirección ganglionar periférica, lo que indica que son órganos linfoides terciarios (TLOs)7,8. Los TLOs se asemejan a los ganglios linfáticos y consisten en linfocitos T, linfocitos B y, con frecuencia, un centro germinal acompañado de linfocitos dendríticos foliculares11,12. Se han descrito casos de TLO en diversas enfermedades inflamatorias crónicas, incluida la obliteración de las vías respiratorias, lo que hace que el modelo IPTT sea adecuado para investigar el papel de los TLO en la obliteración de las vías respiratorias 7,8,11,12,13. En este artículo se presenta la metodología del modelo murino IPTT, con el objetivo de familiarizar a los investigadores con este modelo y facilitar futuras investigaciones sobre la obliteración de las vías respiratorias después de un trasplante pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento de IPTT murino incluye pasos críticos. Con respecto a la anestesia, el primer paso crucial es la intubación endotraqueal. Es fundamental sujetar al ratón a una altura adecuada con las patas sobre la mesa para visualizar las cuerdas vocales y facilitar la intubación inmediata. Además, es necesario un ajuste cuidadoso del volumen respiratorio y de la presión positiva al final de la espiración (PEEP). Normalmente, un volumen respiratorio de 500 μL y una PEEP de 2 cmH2O son suficientes par…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Jerónimo Valero por la edición de este manuscrito. La Figura 1 y la Figura 3I, J, L se crearon con BioRender.com.
Materials
| BALB/cJ | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Donor |
| BD 1 mL Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD PrecisionGlide |
Becton Dickinson | 305122 | |
| Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture | Bovie | DEL1 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 8-10 weeks 25-30 g | Male, Recipient |
| Dumont #5/45 Forceps | F·S·T | 11251-35 | |
| Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers- | Ethicon | LX107 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | F·S·T | 11150-10 | |
| Glover Bulldog Clamp | Integra | 320-127 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | F·S·T | 13009-12 | |
| Horizon Titanium Ligating Clips | Teleflex | 001201 | |
| Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures | Leica | ||
| Magnetix Fixator with spring lock | CD+ LABS | ACD-001 | |
| Microsurgical Scissor | Jarit | 277-051 | |
| Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687 | Harvard | 55-0001 | |
| Perfadex Plus | XVIVO | 19850 | |
| Retractor Tip Blunt – 2.5 mm | CD+ LABS | ACD-011 | |
| small animal table | CD+ LABS | ACD-003 | |
| Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double Armed | Covidien | VP702X | |
| Systane ointment | Alconn | 1444062 | |
| System Elastomer | CD+ LABS | ACD-007 | |
| Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in | Terumo Medical Corporation | SR-OX2025CA | |
| VMT table Top | benson | 91803300 |
Referenzen
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation. J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).
- Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways. American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).
- Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats. Transplantation. 70 (6), 857 (2000).
- Dutly, A. E., et al. A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation. Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).
- Wagnetz, D., et al. Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs. Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).
- Hirayama, S., et al. Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways. Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).
- Watanabe, T., et al. Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Transpl Immunol. 69, 101467 (2021).
- Matsuda, Y., et al. Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation. Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).
- Suzuki, Y., et al. Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).
- Watanabe, T., et al. A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans. Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).
- Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).
- Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin. Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).
- Sato, M., et al. The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation. J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).
- Okazaki, M., et al. Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants. A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).
- Yamada, Y., et al. Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal. Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).
- Watanabe, T., et al. A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).
- Guo, Y., et al. Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels. Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).
