שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום
Summary
במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משכו תשומת לב משמעותית במחקר פיזיולוגי ופתולוגי, אבחון מחלות וטיפול; עם זאת, התרגום הקליני שלהם הוגבל על ידי היעדר גישות ייצור בקנה מידה גדול. לכן, פרוטוקול זה מספק שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) הנגזר מהאנדוזומים, שיש להם תפוקה גבוהה פי 100 בערך משיטת אולטרה-צנטריפוגה קונבנציונלית. בשיטה זו, ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) הופנמו על ידי תאי ההורים באמצעות אנדוציטוזה ולאחר מכן הצטברו בתוך האנדוזומים שלהם. לאחר מכן, אנדוזומים עמוסי MNPs נאספו וטוהרו על ידי טיפול היפוטוני והפרדה מגנטית. הומוגנייזר במהירות גבוהה שימש לפירוק אנדוזומים טעוני MNP לננו-שלפוחיות חד-פיזוריות. השלפוחיות שמקורן באנדוזום המתקבלות הן בעלות אותו מקור ביולוגי ומבנה, ומאופיינות בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וכתם מערבי. המורפולוגיה והרכב החלבונים שלהם דומים לרכבים חשמליים מקומיים, מה שמצביע על כך ש- EMs עשויים לשמש כתחליף בעלות נמוכה ובתפוקה גבוהה של כלי רכב חשמליים מקוריים לתרגומים קליניים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן שלפוחיות קטנות המופרשות כמעט על ידי כל התאים בטווח גדלים של 30-150 ננומטר, המכילות שפע של חומרים ביו-אקטיביים. בהתאם לתא המוצא, כלי רכב חשמליים מראים הטרוגניות גבוהה, בעלי רכיבים מרובים ספציפיים לתאי אב1. כלי רכב חשמליים משתחררים לנוזלי הגוף ומועברים לאתרים מרוחקים, שם הם נלקחים על ידי תאי מטרה לפעולה2, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לספק מגוון רחב של מולקולות ביו-אקטיביות ותרופות לתיקון רקמות, אבחון וטיפול בגידולים ומודולציה חיסונית 3,4. עם זאת, ננו-חלקיקים ביולוגיים אחרים (למשל, ליפופרוטאינים) וננו-שלפוחיות (למשל, כלי רכב חשמליים שמקורם במסלולים שאינם אנדוזומליים) בעלי תכונות ביופיזיקליות דומות בנוזלי גוף משפיעים באופן בלתי נמנע על בידוד וטיהור רכב חשמלי. נכון להיום, אולטרה-צנטריפוגה נותרה תקן הזהב לבידוד רכב חשמלי, ושיטות בידוד אחרות, כולל צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז, אולטרה-סינון, משקעים מפוליאתילן גליקול, כרומטוגרפיה ובידוד חרוזים אימונומגנטי, פותחו5. צוואר הבקבוק הנוכחי המגביל את התרגום הקליני והמסחור של טיפולים ברכב חשמלי הוא המחסור החמור בטכניקות בידוד המאפשרות בידוד מדרגי וניתן לשחזור של כלי רכב חשמליים 6,7,8. טכניקות בידוד מסורתיות של כלי רכב חשמליים (למשל, צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגית וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל) סובלות מתפוקות נמוכות (1 x 107-1 x 108/1 x 106 תאים), מחזור ייצור ארוך (24-48 שעות), יכולת שחזור ירודה של איכות המוצר, ודורשות ציוד ייצור יקר ועתיר אנרגיה שאינו יכול לענות על הביקוש הקליני הנוכחי לרכבים חשמליים6.
חיקויים אקסוזומיים (EMs), פונדקאיות סינתטיות של כלי רכב חשמליים מקומיים, משכו תשומת לב חשובה בשל המבנה, התפקוד והמדרגיות הדומים מאוד שלהם בייצור. המקור העיקרי של EMs הוא מהאקסטרוזיה הישירה של תאי הורים שלמים עם חתך רציף9,10, המדגים פונקציות ביולוגיות חזקות כמו EVs מקומיים11,12. לדוגמה, EMs שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי (hUCMSCs) מפעילים השפעות ריפוי פצעים דומות לאלה של כלי רכב חשמליים מקומיים, והם עשירים יותר בהרכב חלבונים13. למרות EMs נגזר תאים שלמים יש את המורכבות הביולוגית של EVs, החיסרון העיקרי שלהם הוא ההטרוגניות של מוצרים כי הם מזוהמים באופן בלתי נמנע על ידי אברונים תאיים שונים פסולת התא. ניתוח לוקליזציה של חלבונים גילה עוד כי EMs שמקורם באקסטרוזיה של תאים שלמים מכילים חלבונים רבים שאינם ספציפיים ל- EVs מהמיטוכונדריה ומהרשתית האנדופלסמית13. יתר על כן, רוב השיטות לייצור EMs עדיין דורשים אולטרה-צנטריפוגה, תהליך גוזל זמן רב ואנרגיה14. בהתחשב בעובדה שאקסוזומים נגזרים באופן בלעדי מאנדוזומים תאיים, שיערנו כי ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים מהונדסים ביולוגית עשויות לשחזר טוב יותר את ההומולוגיה הביולוגית בין אקסוזומים ו- EMs בהשוואה ל- EMs המבוססים היטב שמקורם בקרום התא המיוצרים בשיטת אקסטרוזיה של תאים שלמים14. עם זאת, הייצור של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזום קשה בשל היעדר גישות בנות קיימא.
מחקרים קליניים בוצעו על ידי שימוש ברכבים חשמליים כתחליף לטיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות ננומטרית לטיפול במחלות שונות. לדוגמה, כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים ממח עצם שימשו לטיפול בדלקת ריאות חמורה שנגרמה על ידי COVID-19 והשיגו תוצאות מבטיחות. לאחרונה, כלי רכב חשמליים מהונדסים גנטית הנושאים חלבוני CD24 הוכיחו גם יתרונות טיפוליים רבי עוצמה לטיפול בחולי COVID-1915,16. עם זאת, הדרישה הקלינית של טיפול ברכב חשמלי עדיין לא יכולה להיענות בשיטות בידוד מסורתיות בגלל התשואה והעלות הנמוכות. מחקר זה מדווח על ייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזום באמצעות גישת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית. הוא מנצל את מסלול האנדוציטוזה של MNPs כדי לבודד אנדוזומים טעוני MNP באמצעות הפרדה מגנטית, ולאחר מכן הומוגניזציה במהירות גבוהה כדי לנסח אנדוזומים לננו-שלפוחיות חד-פיזור. מכיוון שסוגי האנדוזומים הנאספים על ידי פרוטוקול זה מגוונים, עדיין נדרש מחקר מעמיק נוסף כדי לבסס שיטות ייצור נאותות (GMP) בתעשייה. גישה חדשנית זו להכנת EM יעילה יותר בזמן (5 דקות של הומוגניזציה במהירות גבוהה) כדי להשיג ננו-שלפוחיות הומולוגיות לרכבים חשמליים מקומיים. הוא מייצר באופן אקספוננציאלי יותר שלפוחיות מאותן כמויות של תאים מאשר אולטרה-צנטריפוגה, אשר ניתן ליישם בדרך כלל על סוגי תאים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפונדקאית של טיפול ללא תאים ומערכת אספקת תרופות בקנה מידה ננומטרי, כלי רכב חשמליים עדיין לא עמדו בציפיות הקליניות שלהם, ומכשול עיקרי הוא היעדר שיטות ייצור וטיהור ניתנות להרחבה ולשחזור6. לכן, סוגים שונים של EMs פותחו כאנלוגים EV עם מורכבות ביולוגית דומה14. נכון להיום, …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון לרפואה בסיסית וסרטן (IBMC), האקדמיה הסינית למדעים. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC; 82172598), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’ג’יאנג, סין (LZ22H310001), פרויקט הכשרת כישרונות בריאות 551 של ועדת הבריאות של מחוז ג’ג’יאנג, סין, פרויקט המחקר לפיתוח חקלאי וחברתי של לשכת המדע והטכנולוגיה העירונית של האנגג’ואו (2022ZDSJ0474) ומענק המחקר הבין-תחומי Qiantang.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
Referenzen
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
