הדמיה של חלבונים בשפע נמוך ושינויים לאחר תרגום בעוברי דרוזופילה חיים באמצעות הזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר תיוג פלואורסצנטי מותאם אישית מבוסס נוגדנים והזרקה לעוברים מוקדמים של דרוזופילה כדי לאפשר הדמיה חיה של חלבונים בשפע נמוך או שינויים לאחר תרגום שמאתגרים לזיהוי באמצעות גישות GFP/mCherry-tag מסורתיות.
Abstract
הדמיה של חלבונים בתאים חיים באמצעות GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ותגים פלואורסצנטיים אחרים שיפרה מאוד את ההבנה של לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ותפקוד. בהשוואה לאימונופלואורסנציה, הדמיה חיה משקפת בצורה מדויקת יותר לוקליזציה של חלבונים ללא ממצאים פוטנציאליים הנובעים מקיבוע רקמות. חשוב לציין כי הדמיה חיה מאפשרת אפיון כמותי וזמני של רמות החלבונים ולוקליזציה, החיוניים להבנת תהליכים ביולוגיים דינמיים כגון תנועת תאים או חלוקתם. עם זאת, מגבלה עיקרית של גישות תיוג פלואורסצנטי היא הצורך ברמות ביטוי חלבון גבוהות מספיק כדי להשיג הדמיה מוצלחת. כתוצאה מכך, חלבונים פלואורסצנטיים רבים המתויגים אנדוגנית עם רמות ביטוי נמוכות יחסית אינם ניתנים לזיהוי. מצד שני, ביטוי חוץ רחמי באמצעות מקדמי נגיפים יכול לפעמים להוביל לחוסר לוקליזציה של חלבונים או שינויים תפקודיים בהקשרים פיזיולוגיים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מוצגת גישה המשתמשת בזיהוי חלבון בתיווך נוגדנים רגישים ביותר בעוברים חיים, ולמעשה מבצעת אימונופלואורסצנטיות ללא צורך בקיבוע רקמות. כהוכחה עקרונית, ניתן לדמיין בהצלחה קולטן Notch עם תג GFP אנדוגני שבקושי ניתן לגילוי בעוברים חיים לאחר הזרקת נוגדנים. יתר על כן, גישה זו הותאמה כדי להמחיש שינויים פוסט-תרגומיים (PTM) בעוברים חיים, המאפשרים לזהות שינויים זמניים בדפוסי זרחן טירוזין במהלך אמבריוגנזה מוקדמת ולחשוף תת-אוכלוסייה חדשה של פוספוטירוזין (p-Tyr) מתחת לקרומים אפיים. ניתן לשנות גישה זו כך שתתאים לנוגדנים ספציפיים אחרים לחלבון, ספציפיים לתגים או ספציפיים ל-PTM, ועליה להתאים לאורגניזמים אחרים הניתנים להזרקה או לקווי תאים. פרוטוקול זה פותח אפשרויות חדשות להדמיה חיה של חלבונים בעלי שפע נמוך או PTM שבעבר היה מאתגר לזהות באמצעות שיטות תיוג פלואורסצנטיות מסורתיות.
Introduction
אימונופלואורסנציה היא טכניקת אבן פינה בביולוגיה התאית המודרנית שפותחה במקור על ידי אלברט קונס, המאפשרת זיהוי מולקולות בתאי התא הטבעיים שלהן ואפיון ההרכבים המולקולריים של אברונים תת-תאיים או מכונות1. יחד עם מניפולציות גנטיות, immunofluorescence מסייע לבסס את הרעיון המקובל כיום כי לוקליזציה של חלבונים חיונית לתפקודו2. מלבד נוגדנים ראשוניים ספציפיים וצבעים פלואורסצנטיים בהירים, הצלחתה של טכניקה זו נשענת על תהליך מקדים בשם קיבוע וחדירה, המשמר מורפולוגיות תאיות, משתק אנטיגנים ומגביר את נגישות הנוגדנים למדורים תוך תאיים. באופן בלתי נמנע, תהליך הקיבוע והחדירה יהרוג תאים ויסיים את כל התהליכים הביולוגיים3. לכן, immunofluorescence רק מספק תמונות של מסע החיים של חלבונים. עם זאת, תהליכים ביולוגיים רבים כגון נדידת תאים וחלוקות הם דינמיים באופיים, ודורשים חקירה של התנהגויות חלבונים באופן מרחבי-זמני 4,5.
כדי לבחון דינמיקה של חלבונים באורגניזמים חיים, פותחו שיטות הדמיה חיות המבוססות על חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)6 ומיקרוסקופ קונפוקלי מהיר. בקצרה, ניתן לבצע מניפולציה גנטית של החלבון המעניין כדי להתיך אותו עם GFP7, ולאחר מכן לבטא אותו באופן אקטופי ממקדמי נגיפים או שמרים כגון ציטומגלווירוס (CMV)8 או רצף הפעלה במעלה הזרם (UAS)9. מכיוון ש-GFP הוא אוטופלואורסצנטי בטבעו, אין צורך בנוגדנים מצומדים לפלואורופור כדי לחשוף את הלוקליזציה של חלבוני המטרה, מה שעוקף את הצורך בתהליכים מקדימים של קיבוע או חלחול. במהלך שני העשוריםהאחרונים פותחו תגים פלואורסצנטיים המשתרעים על פני כל ספקטרום אורך הגל, המאפשרים הדמיה חיה מרובת צבעים של מספר חלבוני מטרה בו זמנית. עם זאת, בהשוואה לצבעים פלואורסצנטיים מהונדסים כימית כגון AlexaFluor או ATTO, האוטופלואורסצנטיות של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית אלה חלשה יחסית ובלתי יציבה כאשר היא באה לידי ביטוי ממקדמים אנדוגניים, במיוחד במהלך הדמיה חיה על פני טווחי זמן ארוכים יותר10. בעוד שניתן למתן את המחסור הזה על ידי ביטוי יתר של חלבוני מטרה המתויגים באופן פלואורסצנטי, רבים מהם עם פעילויות אנזימטיות כגון קינאזות ופוספטזות משבשים באופן חמור תהליכים ביולוגיים נורמליים אם אינם באים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות.
פרוטוקול זה מציג שיטה המאפשרת הארה של מטרות מבוססות נוגדנים במערך תמונה חיה, ולמעשה מאפשרת אימונופלואורסצנטיות ללא תהליך של קיבוע או חדירה (איור 1). באמצעות תגובת אמין ראשוניתפשוטה מבוססת NHS 11, ניתן להצמיד צבעים פלואורסצנטיים כגון AlexaFluor 488 או 594 עם כל נוגדן ראשוני או GFP/HA/Myc nanobody12. תוך ניצול תכונה התפתחותית שכל התאים העובריים של דרוזופילה חולקים ציטופלסמה משותפת בשלבהסינקיטיום 13, ניתן להשיג קשירה והארה של אנטיגן על פני עוברים שלמים לאחר הזרקת נוגדנים מצומדים. עם הרחבת ספריות של חלבונים מתויגים אנדוגניים הזמינים בדרוזופילה ובמערכות מודל אחרות14, שיטה זו יכולה להרחיב את היישומים של ספריות אלה על ידי חשיפת דינמיקה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטית בשפע נמוך וחלבונים אחרים שאינם מתויגים פלואורסצנטית (HA/Myc-tagged) ברקמות חיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך מוצג זה מתאר את השיטה המיוחדת של תיוג פלואורסצנטי עם נוגדנים מותאמים אישית והזרקה לאחר מכן לעוברי דרוזופילה בשלב מוקדם. טכניקה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של חלבונים או שינויים לאחר תרגום הקיימים בכמויות נמוכות ובדרך כלל קשה לצפות בהם באמצעות שיטות תיוג GFP/mCherry קונבנציונליות.
<p cla…Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר ג’ניפר א. זאלן על אספקת קו Sqh-GFP Drosophila ותמיכה בפיתוח הראשוני של טכניקה זו, ולד”ר פרנסואה שוויסגוט על אספקת קו Notch-GFP Drosophila . עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32270809) ל- H.H.Yu, תמיכה כספית וצוות נדיבה מבית הספר למדעי החיים, SUSTech, ומימון ל- Y. Yan מ- Shenzhen Science and Technology Innovation Commission / JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Referenzen
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
