Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Summary

Zebra balığı embriyo titreşimi ürkütücü tepkisine dayalı olarak kimyasal bileşik toksisitesini değerlendirmek için bir tarama sisteminin iş akışını ve veri analizini açıklıyoruz. Sistem, zebra balığı embriyolarının bir titreşim uyaranına maruz kaldıklarında hareketlerini kaydeder ve genel toksisite/ölümcüllük ve nöromüsküler toksisitenin entegre bir değerlendirmesine izin verir.

Abstract

Zebra balığı embriyolarında nöromüsküler ve genel toksisitenin değerlendirilmesi için basit bir tarama sistemi geliştirdik. Modüler sistem, üzerine embriyolu doku kültürü kaplarının yerleştirilebildiği elektrodinamik transdüserlerden oluşur. Bu tür birden fazla hoparlör-doku kültürü kabı çifti birleştirilebilir. Elektrodinamik transdüserler tarafından üretilen titreşimsel uyaranlar, embriyolarda karakteristik bir irkilme ve kaçış tepkisine neden olur. Kayış tahrikli doğrusal bir tahrik, embriyoların hareketini kaydetmek için her hoparlörün üzerine sırayla bir kamera yerleştirir. Bu şekilde, kimyasal bileşiklerin ölümcüllüğü veya nöromüsküler toksisitesi nedeniyle irkilme tepkisindeki değişiklikler görselleştirilebilir ve ölçülebilir. Embriyoların ve tedavi solüsyonlarının hazırlanması, kayıt sisteminin çalıştırılması ve tahlilde aktif olan bileşiklerin kıyaslama konsantrasyon değerlerini hesaplamak için veri analizi dahil olmak üzere bu sistemi kullanarak kimyasal bileşik taraması için iş akışının bir örneğini sunuyoruz. Piyasada bulunan basit bileşenlere dayalı modüler montaj, bu sistemi hem ekonomik hem de belirli laboratuvar kurulumlarının ve tarama amaçlarının ihtiyaçlarına esnek bir şekilde uyarlanabilir hale getirir.

Introduction

Son yıllarda, zebra balıkları, ilaç geliştirmeden çevresel toksikolojiye kadar araştırma alanlarını kapsayan, kimyasal bileşik etkilerinin değerlendirilmesi için oldukça popüler model organizmalar haline gelmiştir¹. Omurgalılar olarak zebra balıkları, genetik yapılarının ve genel fizyolojilerinin birçok yönünü insanlarla paylaşır ^2,3. Bu nedenle, bu modelde elde edilen sonuçlar genellikle insan sağlığı ile doğrudan ilgilidir. Şu anda klinik çalışmalarda olan birkaç ilaç adayı, zebra balığı⁴ kullanılarak bileşik ekranlarda tanımlanmıştır.

Toksisite değerlendirmesi, zebra balığı embriyonik aşamalarını kullanan testlerin ilgi çekici olduğu önemli bir uygulamadır. Çevresel toksisite testinde zebra balığının kullanımı için çeşitli Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kılavuzları mevcuttur ^5,6. Zebra balığı embriyolarının küçük boyutu ve hızlı gelişimi, onları orta ila yüksek verim ölçeğinde tarama yaklaşımları için son derece uygun hale getirir ^1,3,4. Bu tür taramalar tarafından hedeflenen toksikolojik uç noktalar arasında embriyonik malformasyonlar ve ölümcüllük⁷, endokrin bozulma⁸, organ toksisitesi⁹ ve nöral toksisiteyi gösteren davranışsal değerlendirmeler^10,11 bulunur. Davranışsal tahliller mümkündür çünkü zebra balığı embriyoları, gelişim aşamalarına bağlı olarak farklı uyaranlara çeşitli lokomotor tepkiler gösterir. Örneğin, döllenmeden 1 gün sonra (dpf) embriyolar spontan kuyruk kıvrılmasını¹² gösterir ve fotomotor yanıtı (PMR) ¹⁰ olarak adlandırılan tipik bir hareket dizisi ile bir dizi ışık darbesine yanıt verir. Yumurtadan çıktıktan sonra, tipik olarak döllenmeden (hpf) yaklaşık 48-72 saat sonra meydana gelen, serbestçe yüzen eleutheroembriyolar¹³, 4 dpf¹⁴ civarında başlayan titreşim uyaranlarına yavaş yavaş irkilme ve kaçış tepkileri geliştirir. Bu tepkiler, uyaranın yönünün tersine yöne doğru belirgin bir bükülme (C-bend veya C-start olarak adlandırılır) ile karakterize edilir, bunu daha küçük bir karşı viraj ve yüzme davranışı 14,15,16,17 takip eder. Özellikle, embriyonik davranışlar, çeşitli nörotransmitter sistemleri kullanan nöral devreler tarafından yönetilir ve bu sistemleri hedef alan kimyasal bileşik etkilerinin araştırılmasına izin verir. Örneğin, PMR testi, kolinerjik, adrenerjik ve dopaminerjik sinyallemeye¹⁰ müdahale eden bileşiklerin etkilerini ortaya çıkarırken, irkilme tepkisi kolinerjik, glutamaterjik ve glisinerjik nöronları^{içerir 16,18}. Ayrıca, kaslara veya nöro-müsküler arayüze zarar veren bileşikler, iç kulak/lateral çizgi kıl hücreleri için toksik bileşikler gibi bu davranışları da etkileyecektir^19,20. Bu nedenle, bir uyarana yanıt olarak zebra balığı lokomotor davranışını gözlemlemek, yalnızca nörotoksisiteyi değil, aynı zamanda ototoksisite ve miyotoksisiteyi değerlendirmek için uygun bir araçtır. Lokomotor davranışın puanlanması, ölü embriyolar hareket etmediği için genel toksisite / ölümcüllük değerlendirmesi için bir vekil görevi görür. Bu nedenle, embriyonik hareket davranışları, tek bir kurulumda ölümcül ve nöromüsküler bileşik etkilerini gösteren birinci kademe toksisite tarama yaklaşımı için bütünleştirici bir okumayı temsil eder. Eleutheroembriyoların zaten bileşikleri metabolize edebildiği göz önüne alındığında, yaklaşım aynı zamanda metabolik dönüşüm ürünlerinin^{etkilerini de tespit edebilir 7,21,22}. Daha da önemlisi, zebra balığı embriyoları, 120 hpf^13’ten sonra serbest beslenme aşamasına kadar bazı hayvan koruma mevzuatları kapsamında korunan yaşam evresi olarak kabul edilmemektedir. Bu nedenle, hayvan toksisite testine bir alternatif olarak kabul edilirler.

Şekil 1: Titreşim irkilme tepki sistemi kurulumu. (A) Sisteme genel bakış. Test bileşiklerine maruz kalan embriyolara sahip plakalar, elektrodinamik dönüştürücü dizisine (“hoparlörler”) yerleştirilir. Kamera, kayış tahrikli lineer tahrik tarafından sırayla hedeflenen dönüştürücünün üzerindeki kayıt konumuna hareket ettirilir. (B) Ayrıntılı view üstüne doku kültürü kabı yerleştirilmiş dönüştürücünün/hoparlörün. Plakalar aşağıdan 4000-5000 lükste bir LED ışık levhası ile aydınlatılır. Uyaran verilirken hoparlörün yanındaki bir LED ışığı yanar. (C) Embriyoların uyarılması üzerine kamera tarafından kaydedilen videonun hareketsiz görüntüsü. (D) Yapılandırma dosyasının ekran görüntüsü. (E) Kayıt yazılımı arayüzünün ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada, bir doku kültürü kabında serbestçe hareket eden birkaç embriyonun otomatik bir video kaydı ile birleştirilmiş elektrodinamik transdüserler tarafından üretilen titreşim uyaranlarına dayalı bir kurum içi yapı basit test cihazı kullanarak titreşim irkilme tepkisi üzerindeki bileşik etkilerin değerlendirilmesi için bir test protokolünü açıklıyoruz²³. Sistem modülerdir ve paralel olarak birkaç doku kültürü kabından sıralı kayıt yapılmasına izin verir. Şu anda kullanılan düzenekte, beş elektrodinamik transdüser, üzerlerine yerleştirilmiş 20 embriyo içeren doku kültürü kaplarına titreşimsel bir uyaran (500 Hz, süre 1 ms) sağlar (Şekil 1). Plakalar LED ışık levhaları ile 4000-5000 lux’te alttan aydınlatılır. Her dönüştürücünün yanındaki bir LED ışık, uyaranın uygulama dönemlerini gösterir ve bir osiloskop, uygulanan uyaranın dalga biçimlerini ve frekansını gösterir (ayrıntılar için bkz . Ref. 23). Embriyoların davranışı, saniyede 1000 kare (fps) hızında yüksek hızlı bir kamera (Malzeme Tablosu) tarafından kaydedilir ve bu, kayış tahrikli doğrusal bir sürücü tarafından hedeflenen hoparlörün üzerine taşınır. Bu kayıt hızı, irkilme tepkisini güvenilir bir şekilde çözmek için gereklidir. Sistem, mevcut ticari sistemlere düşük maliyetli, bireysel olarak uyarlanabilir bir alternatif sunar. Aşağıda ayrıntıları verilen kesin iş akışı, seçilen bir dizi toksik madde ile muamele edilen zebra balığı embriyolarından OMICS veri toplama için uygun maruz kalma koşullarını belirlemek amacıyla şu anda Hassas Toksikoloji girişimi²⁴ çerçevesinde gerçekleştirilmektedir.

Protocol

Tüm zebra balığı yetiştiriciliği ve işlemesi Alman hayvan koruma standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Baden-Württemberg Hükümeti, Regierungspräsidium Karlsruhe, Almanya (Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT) tarafından onaylanmıştır. 1. Test edilecek kimyasalların stok çözeltilerinin hazırlanması Cam şişeyi (veya kimyasal alikot) bileşik adı/kısaltması, stok konsantrasyonu ve hazırlama tarihi ile etiketleyin. Örneğin, CdCl2_2.5 g· L-1_210813. Kimyasal alikotu oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca 2000 x g’da santrifüjleyin. Bir çeker ocak altında, bileşiği (gerekirse) 0,001 g’a duyarlı bir ölçekte tartın ve etiketli şişeye aktarın. Bileşik sıvı ise, bir pipet ve plastik pipet ucu kullanarak şişeye ekleyin.NOT: Örneğin, Şekil 2’de gösterilen sonuç örneğinde kullanılan trika metansülfonat stoğu için, etiketli şişeye 400 mg tartıldı. Bir pipet ve plastik pipet ucu kullanarak çözücü (örneğin, bileşiklerin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olarak steril saf su veya dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. Mümkünse, su tercih edilen çözücüdür.NOT: Örneğin, trikin stoğu için 100 mL su içinde 15.3 mM’lik bir çözelti hazırlandı. Şişeyi kapatın, hafifçe sallayın ve yağış olup olmadığını kontrol edin. Pipetler ve plastik pipet uçları kullanarak cam şişelerde seyreltik stok çözeltileri (gerekirse) hazırlayın.NOT: Örneğin, tricaine stoğu için daha fazla seyreltme gerekli değildi. Stok solüsyon(lar)ını kullanana kadar -20 °C’de saklayın. Kalan kimyasal alikotu daha önce olduğu gibi aynı koşullarda saklayın. Stok alikot bilgilerini laboratuvar not defterine kaydedin. 2. Zebra balığı embriyolarının toplanması ve yetiştirilmesi Grup çiftleşmelerinin doğal yumurtlamasından bölünme aşamalarında (2-8 hücre aşaması) embriyoları 10 cm’lik doku kültürü kaplarında toplayın. Uygun kalitede bir parti seçin:% 10’dan az döllenmemiş / ölü yumurta. Bulaşıkları temizleyin (döllenmemiş yumurtaları, kalıntıları, pulları vb. Çıkarın). 10 cm doku kültürü kabına 60 embriyoyu 15 mL E3 ortamına yerleştirin (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)25. Bulaşıkları, suyla ıslatılmış kağıt havluları sererek hazırlanan nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. Embriyoları 28.5 ° C’de bir inkübatörde 72 hpf’ye kadar yükseltin. 3. Test edilecek kimyasalların çalışma seyreltmesinin hazırlanması Stok çözeltiyi -20 °C dondurucudan çıkarın ve çözülmesine izin verin. Bileşik çözünürlüğü yeterince yüksekse, konsantrasyon başına kopya başına 1 mL olmak üzere cam şişelerde E3 ortamında seri seyreltmeler hazırlayın. Konsantrasyonun istenen maruz kalma konsantrasyonundan 10 kat daha yüksek olduğundan emin olun. Bu, maruziyetin başlangıcında embriyoların tüm ortamını değiştirmek zorunda kalmayı önler. Düşük çözünürlük durumunda, seri seyreltmeleri doğrudan istenen maruz kalma konsantrasyonlarında, konsantrasyon başına kopya başına 10 mL hazırlayın. Yağış olup olmadığını kontrol edin (gerekirse). Çözelti çökeldiyse, bunu kaydedin, ardından bir sonraki en yüksek konsantrasyonu elde etmek için daha da seyreltin. Yağış olup olmadığını tekrar kontrol edin. Yağış kalmayana kadar tekrarlayın. Maruz kalma çözeltisinin pH’ını kontrol edin. PH 7.0-8.5 aralığının dışındaysa, bunu kaydedin ve pH’ı HCl veya NaOH ile ayarlayarak 5 mM HEPES/pH 7.4 içeren E3’teki çözeltileri hazırlayın. Kullanılmayan maruz kalma ortamlarını yerel düzenlemelere göre atın. 4. Embriyoların test edilecek kimyasallara maruz bırakılması 72 hpf eski embriyo içeren bulaşıkları ölü / yumurtadan çıkmamış embriyolar için kontrol edin ve çıkarın. Bir grup embriyo, yumurtadan çıkmamış yumurtaların% 5’inden fazlasını içeriyorsa, partiyi çıkarın. 6 cm’lik doku kültürü kabına 10 embriyoyu 9 mL E3 ortamına (pozlama plakası) yerleştirin. Pozlama plakalarını bileşik adı, maruz kalma konsantrasyonu ve çoğaltma numarası ile etiketleyin. Örneğin, “CdCl2 1 mg· L-1 01”. Gerekirse yeterli miktarda E3 içeren plakalar ve bir solvent kontrol plakası ekleyin (bkz. bölüm 5). En düşük konsantrasyondan başlayarak her plakaya 1 mL maruz kalma solüsyonu ekleyin ve plakayı döndürün. Düşük çözünürlüğe sahip bileşikler için, plakanın 10 mL’sinin tamamını maruz kalma çözeltisiyle değiştirin (bkz. adım 3.2.) Embriyolara bileşik çözeltilerin eklendiği zamansal sırayı kaydedin. Plakaları nemlendirilmiş haznede bir inkübatörde 28.5 °C’de 48 saat boyunca 120 hpf’ye ulaşana kadar inkübe edin. 5. Titreşim ürkütücü tahlilinin gerçekleştirilmesi NOT: Plakaları adım 4.5’te kaydedilenle aynı sırayla analiz edin. Her çalışma bir E3 kontrol plakası içermelidir. Bilgisayarı ve titreşim cihazını açın (mavi LED ışığı yanmalıdır). Yapılandırma dosyasını, Şekil 1D’de görüldüğü gibi ve Ek Dosya 1 olarak eklenmiş bir elektronik tabloda hazırlayın. 5 plaka konumunun her biri için maruziyet bilgilerini kaydedin (bileşik, konsantrasyon, çoğaltma). Genel kullanıcı arabirimi (GUI) programını açın (https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit, proje kimliği 43215’te mevcuttur.) GUI programındaki farklı konumları seçerek ve kamera hareketini gözlemleyerek kamera hareketini kontrol edin. Ölçülecek numune plakalarını inkübatörden çıkarın. Numune plakalarını 5 pozisyona yerleştirin (bkz. Şekil 1A, “hoparlörler”) ve embriyoların birkaç dakika oturmasına izin verin. Kaydet’e tıklayın; Yapılandırma dosyasını seçmek için bir pencere açılacaktır. Bu çalıştırma için adım 5.2’de hazırlanan uygun yapılandırma dosyasını seçin. Numune açıklamasının her konumdaki (1-5) numunelere karşılık gelip gelmediğini kontrol edin. Ölçüm otomatik olarak yapılacaktır (10 s / konum). Program tarafından ses darbesi uygulandığında, bir LED yanar. 10 s/pozisyon için kayıt, uyaran uygulanmadan önce ve sonra yüzme hızını ve kat edilen mesafeyi tahmin etmek için yeterli veri elde edilmesini sağlar ve sonraki uyaranlara alışmayı önler. Kayıt tamamlandığında, kamera 1 konumuna geri döner ve yazılım dosyaları sıkıştırmaya başlar. Bu süre zarfında, numuneleri ölçülmesi gereken bir sonraki setle değiştirin. Adım 5.2’ye gidin. bir sonraki çalıştırmayı kaydetmek için. Tüm plakalar ölçüldüğünde, pozlama solüsyonlarını toplayın. Embriyoları tutmak için bir elek kullanın. Embriyoları bir buz / izopropanol (% 5) banyosunda hızlı bir şekilde soğutarak ötenazi yapın. Maruz kalma solüsyonlarını ve ölü embriyoları yerel yönetmeliklere göre atın. 6. Veri analizi Video verilerini VirtualDub (1.10.4) ile açın. Ses darbesine yanıt veren embriyo sayısını görsel olarak puanlayın (kontrol LED’i açıkken). Verileri bir e-tabloya girin. Şekil 2C’de gösterilen örnek veri kümesini içeren Ek Dosya 2’de sağlanan şablona göre bileşik adını, kopyayı, bileşiğin konsantrasyonunu ve hareketsiz embriyoların yüzdesini kaydedin.NOT: Şablon esnek bir yapıya sahiptir ve temel olarak diğer organizmaların ve uç noktaların verileri için uygulamaya izin verir. Her konsantrasyon için yanıtları açıklar ve ayrıca son nokta açıklamalarının yanı sıra sonraki konsantrasyon-yanıt modellemesinde üretilen parametrelerin tanımlarını sağlar. Gömülü R komut dosyaları (R sürüm 3.6., R-paketleri, plotrix, drc ve bmd27,28) ile bir KNIME iş akışı (KNIME analitiği 4.626) kullanarak kıyaslama konsantrasyonu (BMC) analizini gerçekleştirin.NOT: Prensip olarak, değerlendirme doğrudan R’de de yapılabilir. Bununla birlikte, kolaylık sağlamak ve web tabanlı bir hizmet olarak değerlendirmeye izin vermek için analiz, KNIME sunucusuyla uyumlu bir iş akışında düzenlenmiştir. KNIME iş akışının çıktısı Ek Dosya 3’te sağlanır. KNIME iş akışı tarafından oluşturulan istatistiksel parametrelerle ilgili ayrıntılar için bu şablona bakın. Uyum iyiliğini tahmin etmek için istatistiksel parametreler ve belirlenen BMC değerlerini kabul etmek için eşikler Tablo 1’de gösterilmektedir. KNIME iş akışının kendisi GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc) aracılığıyla kullanılabilir. Konsantrasyon tepkisi, 4 parametreli bir log-lojistik model kullanılarak modellenmiştir. Eğri uydurma parametrelerinden ikisi sabitlenebilir. Tipik olarak, yüzde verileri söz konusu olduğunda maksimum değer 100’e sabitlenir. Herhangi bir arka plan etkisi gözlenmemesi durumunda, minimum %0’a sabitlenebilir.

Representative Results

Şekil 2A , tedavi edilmemiş vahşi tip embriyoların (AB2O2 suşu) 48 kavramasındaki hareketsiz embriyoların yüzdesini göstermektedir. Ortalama olarak, tedavi edilmemiş vahşi tip embriyoların .33’ü titreşim uyaranına tepki vermez. 4 kavramada, hareketsiz larvaların yüzdesi% 50’ye ulaştı, ancak% 75’inde hareketsiz larva yüzdesi% 20’nin altındaydı. Şekil 2B,C, şu anda PrecisionTox konsorsiyumu24 içinde gerçekleştirildiği gibi, titreşim irkilme testi iş akışı ile motilite üzerindeki bileşik etkiler için bir kıyaslama konsantrasyonu/dozunun (BMC/BMD29,30) tipik bir hesaplamasının bir örneğini göstermektedir. BMC10, BMC25 ve BMC50 değerleri, embriyoların sırasıyla , ve ‘sinin arka plandan daha yüksek hareketsizlik seviyeleri gösterdiği konsantrasyonlara karşılık gelir. Bu hesaplamaya sadece tamamen hareketsiz olan embriyolar dahil edilir, daha sonra kaçış yüzme veya sadece kuyruk hareketleri olmadan sadece bir C-bendi gibi kısmi tepkiler gösterenler dahil edilmez (Şekil 2B). Embriyolar, balık anestezisi için sıklıkla kullanılan sodyum kanal inhibitörü trikain metansülfonatın 8 konsantrasyonuna maruz bırakıldı31. Veriler, titreşim uyaranına yanıt olarak yaklaşık ‘lik bir hareketsizlik arka plan seviyesini göstermektedir. % 1 trikainden başlayarak motilite azalır ve% 2.5’in üzerinde durur. KNIME iş akışı, BMC50’yi 164.9 μM olarak hesaplar, bu da %1.07 trikaya ve ‘lik bir hareketsizlik seviyesine karşılık gelir (Şekil 2C). Küçük güven aralıkları (eğrideki gri tonlarla gösterilir), bu testteki motilite değerlerinin sağlam bir şekilde tekrarlanabilirliğini gösterir. Şekil 2D, verileri BMC hesaplamaları için kullanılmaması gereken optimal olmayan bir tahlil çalışmasının bir örneğini göstermektedir. Aynı kavramadan türetilen farklı embriyolara sahip beş E3 ile tedavi edilmiş kontrol grubu gösterilmiştir (AB2O2 [vahşi tip suş] 1-5’i çoğaltır). Sadece ilk grup, Şekil 2A’da gösterildiği gibi, literatür değerleri32 ve burada açıklanan tahlilde elde edilenlerle tutarlı olan yaklaşık% 25 hareketsizlik gösteren normale yakın bir yanıt gösterirken, diğer tüm gruplar azalmış ve/veya eksik davranışsal tepkiler gösterir (örneğin, yüzme aktivitesinin takip etmediği sadece bir C-bendi veya başlangıçta net bir C-bendi olmayan motilite). Böyle bir yanıt, embriyolar düzgün gelişmediğinde ve gelişimsel gecikme nedeniyle olgunlaşmamış bir durumda olduğunda ortaya çıkabilir ve bu da irkilme tepkisininsağlamlığını etkiler 14,33. Şekil 2: Kıyaslama dozu hesaplaması da dahil olmak üzere tipik bir sonuç örneği. (A) 48 kavrama için vahşi tip tedavi edilmemiş larvalar için ses darbesinden sonra yanıt vermeyen embriyoların yüzdesi (debriyaj başına n = 10). Ortalama (.33) ve standart sapma (%±16.19) kırmızı ile gösterilmiştir. (B) E3 ortamında belirtilen trikain konsantrasyonu veya kontrol olarak tek başına E3 ile tedavi edilen embriyoların (koşul başına n = 20) irkilme tepkisi davranışının değerlendirilmesi. Davranış, grafiğin sağında belirtilen renk şemasına ve karikatürlere göre sınıflandırılır ve her embriyo aşağıdaki sınıflardan yalnızca birine atanır: “hareketsiz”: embriyo herhangi bir hareket göstermez; “kuyruk hareketi”: embriyo kuyruk hareketi gösterir, ancak ne C-bükülme ne de yüzme davranışı; “hareketli”: embriyo yüzme hareketi gösterir, ancak titreşim uyaranına yanıt olarak C-bükülmesi yoktur; “Sadece C-bend”: embriyo C-bend gösterir, ancak yüzmeden kaçmaz; “C-bend + motile”: embriyo tipik C-bend davranışını gösterir ve ardından yüzmeden kaçar (tipik tam irkilme tepkisi). Farklı davranışlar, her tedavi için toplam embriyo sayısının yüzdesi olarak gösterilir. (C) KNIME iş akışı tarafından oluşturulan ve her tedavi konsantrasyonu için “hareketsiz” embriyoların yüzdesini gösteren BMC hesaplama grafiği. Mavi, kırmızı ve siyah çizgiler BMC10, BMC25 ve BMC50 değerlerini, yani embriyoların sırasıyla , ve ‘sinin arka plandan daha yüksek hareketsizlik seviyeleri gösterdiği konsantrasyonları gösterir. (D) Atılmış bir tahlil çalışması örneği. Aynı kavramadan türetilen farklı AB2O2 vahşi tip embriyolarla E3 ile tedavi edilen beş kontrol çalışması gösterilmiştir (1-5 kopyası). Sadece kopya 1 neredeyse normal bir tepki gösterirken, kalan koşuların embriyoları tipik C-bend + kaçış yüzme tepkisini göstermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 1: Uyum iyiliğini tahmin etmek için istatistiksel parametreler ve belirlenen BMC değerlerini kabul etmek için eşikler. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Tablo 2: Titreşimsel irkilme tepkisi tahlil sistemlerinin bir seçiminin özellikleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: Yapılandırma dosyası için Excel şablonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 2: Örnek bir veri seti içeren KNIME giriş şablonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 3: KNIME çıktı dosyası örneği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Özel yapım bir zebra balığı embriyo titreşim ürkütücü test kurulumu kullanarak kimyasal bileşik değerlendirmesi için iş akışını ve veri analizini sunuyoruz. İş akışı, kıyaslama konsantrasyonu/dozu (BMC/BMD) gibi bileşik toksisitesini belirten tipik parametrelerin hesaplanmasına olanak tanıyan sağlam veriler üretir. Kurulumun modülerliği, verim ve alan gereksinimleri için farklı ihtiyaçlara uyum sağlar. Sistem, nispeten basit bir kurulumun ardından düşük maliyetli bazal bileşenlerden yapıldığından, genellikle aynı anda birkaç tahlil türü için tasarlanan, tescilli yazılıma dayanan ve nispeten maliyetli olan mevcut ticari sistemlere ucuz bir alternatif sunar.

Hem bu ticari sistemler hem de diğer ısmarlama sistemler, çok kuyulu plakalarda tek embriyoların veya larvaların değerlendirilmesine izin verir (örneğin, 12 kuyulu³⁴, 16 oyuklu^32,35, 24-kuyulu 20,33,36, 48-kuyucuklu³⁷, 96-kuyucuklu 38,39,40,41,42 ve hatta 384-kuyulu [4×96 kuyu olarak]⁴³), ancak kuyulardaki uzamsal kısıtlama, kaçış tepkisinin bazı veri parametrelerinin (örneğin, kat edilen mesafe) analizini daha zor hale getirir. Ayrıca, bu kurulumların bazılarında görüntüleme, plakanın kuyularının bir alt kümesiyle sınırlıdır ve bu da verimi^36,39 azaltır. Embriyoların bulaşıklarda görüntülenmesi, kaçış yanıtı parametrelerinin daha iyi değerlendirilmesine olanak tanır ve aynı anda birkaç embriyonun davranışının kaydedilmesini sağlar (örneğin 6 cm’lik bir tabakta 30’a kadar). Genellikle, çanak tabanlı görüntüleme, çalışma başına bir tabak ile sınırlıdır 44,45,46,47,48 (istisnalar, her biri bir larva içeren 6 tabakta⁴⁹ veya 2 bölünmüş tabakta 4 larva^{üzerinde paralel görüntüleme gerçekleştirir 50}), bizim durumumuzda olduğu gibi paralel tasarımlarla çözülebilecek bir dezavantaj. Bu çalışmada kullanılan sistemin bazı özelliklerini ve diğer ticari ve ısmarlama çözümleri Tablo 2’de özetledik 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50^,
51,52.

Yöntemin bir avantajı, toksisite değerlendirmelerinin performansını artırabilen hem ölümcüllüğü hem de davranış değişikliklerini yakalayan bir okumadır. Örneğin, zebra balığı embriyosu akut toksisite testinin (FET)⁵ yetişkin balık akut toksisite testinde⁵³ toksisiteyi oldukça iyi tahmin ettiği gösterilmiş olsa da, davranışsal okumalar⁵⁴ dahil edilerek tahmin doğruluğu iyileştirilmiştir. Bunun nedeni, muhtemelen yavru veya yetişkin balıklarda artan toksisiteye neden olan solunum yetmezliği sendromunun olmaması nedeniyle, balık embriyolarında görülen nöroaktif bileşiklerin neden olduğu zayıf ölüm oranıdır. Bununla birlikte, nöroaktivite, davranışın değerlendirilmesi ile tanımlanabilir. Ayrıca, davranışsal okumalar, miyotoksik ve ototoksik etkilerin yanı sıra, fizyoloji üzerinde, öldürücü olmayan ancak organizmanın davranışsal performansını etkileyen diğer, daha ince toksik etkileri de yakalayabilir.

Testi gerçekleştirirken, homojen olarak gelişen bir zebra balığı embriyosu partisinin kullanılmasının yanı sıra bileşiklerin uygun şekilde işlenmesini sağlamak çok önemlidir. Bu nedenle, bileşik depolama için cam şişelerin kullanılması, plastik malzemeye absorbans nedeniyle kimyasalların, özellikle hidrofobik bileşiklerin konsantrasyonlarındaki düşüşü en aza indirmelidir. “Plastik” polistirene yüksek emme potansiyeline sahip bileşikler söz konusu olduğunda, inkübasyon için cam plakalar da kullanılabilir. Ölü embriyoların toplanması ve uzaklaştırılması için kullanılan doku kültürü kaplarındaki yumurtaların temizlenmesi standart gelişimin sağlanması için kritik bir adımdır. Gelişimsel gecikmeler, değerlendirilen davranışın altında yatan sinir ağlarının olgunluğunu etkileyebileceğinden, normal gelişim hızı önemlidir^14,33. Ayrıca, bileşik etkilerin karşılaştırılmasını sağlamak için, farklı suşların farklı davranış profilleri sunduğu bildirildiğinden, yumurtalar aynı suştan türetilmelidir 38,55,56,57. Maruz kalma sırasında, test edilen konsantrasyonları değiştirecek olan E3 ortamının aşırı buharlaşmasını önlemek için embriyoların nemlendirilmiş bir odada inkübe edilmesi önemlidir.

Test serisinde kullanılan belirli embriyo grubunun temel yanıt seviyesini belirlemek için her çalışmaya E3 kontrolleri dahil edilmelidir. Tipik olarak, her 5 ölçüm seti boyunca bir kontrol plakası çalıştırırız. Şekil 2D’de gösterildiği gibi, bu yaklaşım aynı zamanda gecikmiş gelişim veya genetik arka plan etkileri gibi diğer nedenlerden dolayı optimal olmayan yanıtlara sahip partilerin tespit edilmesine de izin verir. Uyarana beklenmedik bir yanıt eksikliği durumunda, olası dönüştürücü arızasına da dikkat edin. Tipik olarak, irkilme tepkileri, bir log-lojistik model kullanılarak eğri uydurmaya izin veren sigmoidal bir konsantrasyon-tepki davranışı gösterir. Bununla birlikte, bifazik yanıtları olan nadir durumlarda, Gauss veya Cedergreen modelleri gibi başka modellerin kullanılması gerekebilir. R paketleri drc ve bdm^27,28 içinde mevcutturlar.

Titreşimsel uyarana yanıt eksikliği, genel sitotoksisite nedeniyle embriyoların ölümünü veya ciddi şekilde bozulmuş yaşam fonksiyonlarını gösterebilir, ancak aynı zamanda uyaran algısı, entegrasyon ve lokomotor çıktının nöral devrelerini hedef alan daha spesifik toksisiteyi de yansıtabilir. Diğer olası bileşik etkiler, nöromüsküler arayüze veya kas yapısı ve işlevine müdahaledir. Bu olasılıkları ayırt etmek için daha fazla tahlil gereklidir. Örneğin, kasların yapısal bütünlüğü bir çift kırılmalılık testi ^58,59 ile değerlendirilebilir ve kas ve nöral fonksiyonun uygunluğunu değerlendirmek için transgenik çizgiler^{mevcuttur 60,61}. Bununla birlikte, kaydedilen video verileri, ilk ek bilgiyi sağlayabilecek embriyoların morfolojisinin ve davranışsal tepkisinin daha ayrıntılı bir analizine zaten izin vermektedir. Sadece C-bendi mi yoksa tüm motilite mi bozuldu? Zayıf veya titreyen kuyruk hareketleriyle gösterildiği gibi hala nöromüsküler aktivite kalıntıları var mı? Bu tür değişmiş davranışlar, ödem veya artmış vücut eğriliği gibi morfolojideki değişikliklerle birlikte mi gidiyor? Ek olarak, C-virajına kadar gecikme süresi veya kaçış tepkisi sırasında kat edilen mesafe gibi parametreler değerlendirilebilir (bkz.ample, Ref. 44).

Burada açıklanan tarama protokolü, öldürücü olmayan nörotoksik, ototoksik ve miyotoksik bileşikleri spesifik olarak tespit etme katma değeri ile hızlı ve sağlam bileşik toksisite değerlendirmelerine izin verir. Sağlanan analiz iş akışının uygulanması kolaydır ve sağlam bir okuma sağlar. Titreşim irkilme tahlilinde kullanılan uyaran protokollerinin modifikasyonları, darbe öncesi inhibisyon (PPI)^39,44 ve alışkanlık^32,33 gibi irkilme davranışının daha karmaşık yönleri üzerindeki bileşik etkileri ele almak için kullanılmıştır ve bu çalışmada kullanılan elektrodinamik dönüştürücü tabanlı uyaran kurulumuna uyarlanabilir.

İrkilme tepkisine dayalı tarama sistemlerinin ana uygulaması, hem insan toksisite değerlendirmesi hem de ilaç geliştirme^ile ilgili olan kimyasal ekranlardaki bileşik etkilerin değerlendirilmesidir ^1,4,62. Aynı zamanda, suda yaşayan bir organizmanın erken yaşam evrelerini test ederek, elde edilen sonuçlar ekotoksikolojik risk değerlendirmesi ile doğrudan ilgilidir^63,64. Ek olarak, irkilme tepki sistemleri genetik taramalarda^{davranışsal} fenotipleme için kullanılabilir 65,66,67,68,69. Kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir sistemimiz, bu çeşitli uygulama alanlarında kendi özel tarama projelerini yürütmek isteyen daha küçük laboratuvarlara uygun maliyetli bir kurulum sağlar.

Materials

Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm	Sigma-Aldrich	Z289744-1EA	Or comparable material
High-speed camera	XIMEA	MQ013MG-ON USB 3
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap	VWR	215-3261	Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material
Pipette tip, working volume: 10 µL	SARSTEDT	70.3010.210	Or comparable material
Pipette tip, working volume: 1000 µL	SARSTEDT	70.3050.100	Or comparable material
Pipette tip, working volume: 20 µL	SARSTEDT	70.3020.210	Or comparable material
Pipette tip, working volume: 200 µL	SARSTEDT	70.3030.100	Or comparable material
Serological pipette 10 mL	SARSTEDT	86.1254.001	Or comparable material
Serological pipette 25 mL	SARSTEDT	86.1685.001	Or comparable material
Serological pipette 5 mL	SARSTEDT	86.1253.001	Or comparable material
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)	Greiner bio-one	628102	Or comparable material
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)	SARSTEDT	83.3902.500	Or comparable material
Transfer pipette 6 mL	SARSTEDT	86.1175	Or comparable material
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP	SARSTEDT	62.554.502	Or comparable material
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP	SARSTEDT	62.5472.54	Or comparable material