Generazione e analisi a valle di trascrittomi a singola cellula e a singolo nucleo in organoidi cerebrali
Summary
Qui, introduciamo un protocollo completo per la generazione e l’analisi a valle di organoidi cerebrali umani utilizzando il sequenziamento dell’RNA a singola cellula e a singolo nucleo.
Abstract
Nell’ultimo decennio, la trascrittomica a singola cellula si è evoluta in modo significativo ed è diventata un metodo di laboratorio standard per l’analisi simultanea dei profili di espressione genica delle singole cellule, consentendo la cattura della diversità cellulare. Al fine di superare i limiti posti dai tipi di cellule difficili da isolare, è possibile utilizzare un approccio alternativo che mira a recuperare singoli nuclei anziché cellule intatte, rendendo la profilazione del trascrittoma delle singole cellule universalmente applicabile. Queste tecniche sono diventate una pietra miliare nello studio degli organoidi cerebrali, affermandoli come modelli del cervello umano in via di sviluppo. Sfruttando il potenziale della trascrittomica a singola cellula e a singolo nucleo nella ricerca sugli organoidi cerebrali, questo protocollo presenta una guida passo-passo che comprende procedure chiave come la dissociazione degli organoidi, l’isolamento di singole cellule o nuclei, la preparazione e il sequenziamento delle librerie. Implementando questi approcci alternativi, i ricercatori possono ottenere set di dati di alta qualità, consentendo l’identificazione di tipi di cellule neuronali e non neuronali, profili di espressione genica e traiettorie di linea cellulare. Ciò facilita indagini complete sui processi cellulari e sui meccanismi molecolari che modellano lo sviluppo del cervello.
Introduction
Negli ultimi anni, le tecnologie degli organoidi sono emerse come uno strumento promettente per la coltura di tessuti simili a organi 1,2,3. Soprattutto per gli organi che non sono facilmente accessibili, come il cervello umano, gli organoidi offrono l’opportunità di ottenere informazioni sullo sviluppo e sulla manifestazione della malattia4. In quanto tali, gli organoidi cerebrali sono stati ampiamente utilizzati come modello sperimentale per studiare vari disturbi del cervello umano, tra cui malattie dello sviluppo, psichiatriche o persino neurodegenerative 4,5,6.
Con l’avvento delle tecnologie di profilazione del trascrittoma a singola cellula, i tessuti umani primari e i modelli complessi in vitro potrebbero essere studiati con un livello di granularità senza precedenti, fornendo informazioni meccanicistiche sui cambiamenti dell’espressione genica a livello di sottopopolazioni cellulari in salute e malattia e fornendo informazioni su nuovi bersagli terapeutici putativi 7,8,9. Il campo degli organoidi è progredito utilizzando il profilo del trascrittoma a singola cellula per valutare la composizione cellulare, la riproducibilità e la fedeltà delle tecnologie degli organoidi cerebrali 10,11,12. Il sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha permesso la classificazione cellulare e l’identificazione della disregolazione genetica negli organoidi malati13,14. È importante sottolineare che è la complessità dei tessuti organoidi che richiede l’implementazione di tecniche che consentano la profilazione delle singole cellule. La caratterizzazione degli organoidi utilizzando metodi come la profilazione del trascrittoma di massa (sequenziamento dell’RNA di massa) porta all’eterogeneità cellulare mascherata e ai profili di espressione genica che sono mediati in tutti i tipi di cellule all’interno del tessuto complesso, limitando in ultima analisi la nostra comprensione dei processi in corso durante lo sviluppo degli organoidi in salute e malattia 15,16,17. Man mano che i metodi scRNA-seq continuano ad avanzare, viene creato un numero crescente di atlanti, esemplificato da risorse come l’Allen Brain Atlas o l’atlante a cellula singola di organoidi cerebrali umani di Uzquiano et al.18.
Il successo dello scRNA-seq da organoidi cerebrali si basa su un efficace isolamento e cattura di cellule intatte. Poiché la dissociazione degli organoidi cerebrali per ottenere singole cellule si basa sulla digestione enzimatica, può influenzare i modelli di espressione genica inducendo stress e danno cellulare19,20. Quindi, la dissociazione del tessuto in singole cellule è il passaggio più cruciale. Un approccio alternativo è il sequenziamento dell’RNA a nucleo singolo (snRNA-seq), che facilita l’estrazione senza enzimi di nuclei da tessuti freschi e congelati21,22. Tuttavia, l’isolamento dei nuclei da un tessuto pone altre sfide come l’arricchimento dei tipi di cellule di interesse e il basso contenuto di RNA dei nuclei rispetto alle cellule.
Gli studi con trascrittoma degli organoidi cerebrali sono comunemente condotti utilizzando scRNA-seq 10,18,23. Tuttavia, l’isolamento di singoli nuclei potrebbe fornire un metodo ortogonale e supplementare per studiare il profilo trascrittomico degli organoidi. Qui, introduciamo una cassetta degli attrezzi per scRNA- e snRNA-seq per organoidi cerebrali e discutiamo i punti critici per ottenere dati di sequenziamento della migliore qualità.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analisi trascrittomica di singole cellule e singoli nuclei è emersa come uno strumento fondamentale per comprendere i meccanismi di regolazione genica all’interno di tessuti complessi. Entrambi i metodi consentono studi sul trascrittoma di organoidi cerebrali. Per garantire un esperimento complessivamente riuscito, la qualità del materiale di partenza è di grande importanza. Pertanto, è necessario tagliare regolarmente gli organoidi per evitare la formazione di un nucleo necrotico26. È anch…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Valeria Fernandez-Vallone per le istruzioni originali per il kit di dissociazione neurale Miltenyi. Ringraziamo anche la Genomics Technology Platform del Max Delbrueck Centrum per aver fornito la ricetta del tampone di lisi NP40 e i preziosi consigli per la messa a punto di questo protocollo. Ringraziamo anche Margareta Herzog e Alexandra Tschernycheff per il supporto organizzativo del laboratorio.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
Referenzen
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
- Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
- Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
- Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
- Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
- Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
- Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
- Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
- Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
- Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).
