Fenotipagem baseada em imagem de alto rendimento para determinar respostas morfológicas e fisiológicas a estresses únicos e combinados em batata

Summary

Projetamos um protocolo de fenotipagem baseado em imagem para determinar as respostas morfológicas e fisiológicas a tratamentos únicos e combinados de calor, seca e alagamento. Essa abordagem permitiu a identificação de respostas precoces, tardias e de recuperação em todo o nível da planta, particularmente nas partes acima do solo, e destacou a necessidade de usar vários sensores de imagem.

Abstract

A fenotipagem baseada em imagem de alto rendimento é uma ferramenta poderosa para determinar de forma não invasiva o desenvolvimento e o desempenho de plantas sob condições específicas ao longo do tempo. Usando vários sensores de imagem, muitas características de interesse podem ser avaliadas, incluindo biomassa vegetal, eficiência fotossintética, temperatura do dossel e índices de refletância foliar. As plantas são frequentemente expostas a múltiplos estresses em condições de campo, onde ondas de calor severas, inundações e eventos de seca ameaçam seriamente a produtividade das culturas. Quando as tensões coincidem, os efeitos resultantes nas plantas podem ser distintos devido a interações sinérgicas ou antagônicas. Para elucidar como as plantas de batata respondem a estresses únicos e combinados que se assemelham a cenários de estresse que ocorrem naturalmente, cinco tratamentos diferentes foram impostos a uma cultivar de batata selecionada (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) no início da tuberização, ou seja, controle, seca, calor, alagamento e combinações de estresses de calor, seca e alagamento. Nossa análise mostra que o estresse por encharcamento teve o efeito mais prejudicial no desempenho da planta, levando a respostas fisiológicas rápidas e drásticas relacionadas ao fechamento estomático, incluindo uma redução no rendimento quântico e na eficiência do fotossistema II e um aumento na temperatura do dossel e no índice de água. Sob calor e tratamentos de estresse combinados, a taxa de crescimento relativo foi reduzida na fase inicial do estresse. Sob seca e estresses combinados, o volume das plantas e o desempenho fotossintético caíram com o aumento da temperatura e o fechamento dos estômatos na fase tardia do estresse. A combinação de tratamento otimizado de estresse sob condições ambientais definidas, juntamente com protocolos de fenotipagem selecionados, permitiu revelar a dinâmica das respostas morfológicas e fisiológicas a estresses únicos e combinados. Aqui, uma ferramenta útil é apresentada para pesquisadores de plantas que buscam identificar características de plantas indicativas de resiliência a vários estresses relacionados às mudanças climáticas.

Introduction

Os efeitos potenciais das mudanças climáticas, incluindo o aumento da intensidade e frequência de ondas de calor, inundações e eventos de seca, têm impactos negativos no cultivo¹. É importante entender a influência das mudanças climáticas na variabilidade das culturas e as consequentes flutuações na produção anual das culturas². Com o aumento da população e da demanda por alimentos, manter o rendimento das plantas cultivadas é um desafio, portanto, encontrar culturas resistentes ao clima para reprodução é urgentemente necessário ^3,4. A batata (Solanum tuberosum L.) é uma das culturas alimentares essenciais que contribui para a segurança alimentar global devido ao seu alto valor nutricional e maior eficiência no uso da água. No entanto, a redução do crescimento e da produtividade em condições desfavoráveis é um problema principal, principalmente nas variedades suscetíveis ^5,6. Muitos estudos destacaram a importância de investigar abordagens alternativas para manter a produtividade da cultura da batata, incluindo práticas agrícolas, encontrar genótipos tolerantes e entender o impacto do estresse no desenvolvimento e rendimento ^7,8,9, que também é altamente exigido pelos produtores (ou agricultores) europeus de ^batata10.

Plataformas automatizadas de fenotipagem, incluindo fenotipagem baseada em imagem, permitem as análises quantitativas da estrutura e função da planta que são essenciais para selecionar características relevantes de interesse^11,12. A fenotipagem de alto rendimento é uma técnica avançada não invasiva para determinar várias características morfológicas e fisiológicas de interesse de maneira reprodutível e rápida ¹³. Embora o fenótipo reflita diferenças genotípicas em conexão com os efeitos ambientais, a comparação de plantas sob condições controladas com estresse permite vincular as extensas informações de fenotipagem a uma condição específica (estresse)¹⁴. A fenotipagem baseada em imagem é essencial na descrição da variabilidade fenotípica e também é capaz de rastrear um conjunto de características ao longo do desenvolvimento da planta, independentemente do tamanho da população¹⁵. Por exemplo, a medição de características morfológicas, incluindo a forma, tamanho e índice de cor das folhas usando sensores de imagem vermelho-verde-azul (RGB), é usada para determinar o crescimento e o desenvolvimento das plantas. Além disso, as medições de características fisiológicas, incluindo desempenho fotossintético, temperatura do dossel e refletância foliar, são quantificadas usando vários tipos de sensores, como fluorescência de clorofila, infravermelho térmico (IR) e imagem hiperespectral¹⁶. Estudos recentes em ambientes controlados mostraram o potencial do uso da fenotipagem baseada em imagens na avaliação de diferentes mecanismos e respostas fisiológicas de plantas sob estresses abióticos, como calor na batata¹⁷, seca na cevada¹⁸, arroz¹⁹ e seca combinada e tratamentos térmicos no trigo²⁰. Embora o estudo das respostas das plantas a múltiplas interações de estresse seja complexo, as descobertas revelam novos insights na compreensão dos mecanismos das plantas para lidar com as rápidas mudanças nas condições climáticas²¹.

As respostas fisiológicas e morfológicas das plantas são diretamente influenciadas por condições abióticas de estresse (alta temperatura, déficit hídrico e inundação), resultando em redução da produtividade²². Embora a batata tenha uma alta eficiência no uso da água em comparação com outras culturas, o déficit hídrico afeta negativamente a quantidade e a qualidade do rendimento devido à arquitetura de raízes rasas⁵. Dependendo da intensidade e duração do nível de seca, o índice de área foliar é reduzido e o retardo no crescimento do dossel com inibição da formação de novas folhas é pronunciado durante os estágios posteriores do estresse, levando a uma redução na taxa fotossintética²³. O nível limite de água é crítico com excesso de água ou períodos prolongados de seca, resultando em um efeito negativo no crescimento das plantas e no desenvolvimento dos tubérculos devido à limitação de oxigênio, diminuição da condutividade hidráulica das raízes e restrição das trocas gasosas^24,25. Além disso, as batatas são sensíveis a altas temperaturas, onde temperaturas acima dos níveis ideais resultam em taxas atrasadas de iniciação, crescimento e assimilação dos tubérculos²⁶. Quando os estresses aparecem em combinação, as regulações bioquímicas e as respostas fisiológicas diferem das respostas individuais ao estresse, destacando a necessidade de investigar as respostas das plantas às combinações de estresse²⁷. Estresses combinados podem resultar em reduções (ainda mais) severas no crescimento das plantas e efeitos determinantes nas características relacionadas à reprodução²⁸. O impacto da combinação de estresse depende da dominância de cada estresse sobre os outros, levando a uma resposta aprimorada ou suprimida da planta (por exemplo, a seca geralmente leva ao fechamento dos estômatos enquanto os estômatos estão abertos para permitir o resfriamento da superfície da folha sob estresse térmico). No entanto, a pesquisa combinada de estresse ainda está surgindo, e mais investigações são necessárias para entender melhor a complexa regulação que medeia as respostas das plantas nessas condições²⁹. Assim, este estudo tem como objetivo destacar e recomendar um protocolo de fenotipagem usando múltiplos sensores de imagem que pode ser adequado para avaliar as respostas morfofisiológicas e entender os mecanismos subjacentes do desempenho geral da batata sob tratamentos de estresse simples e combinados. Conforme a hipótese, a combinação de vários sensores de imagem provou ser uma ferramenta valiosa para caracterizar as estratégias iniciais e posteriores durante a resposta ao estresse da planta. A otimização do protocolo de fenotipagem baseado em imagem será uma ferramenta interativa para pesquisadores e melhoristas de plantas encontrarem características de interesse para tolerância ao estresse abiótico.

Protocol

1. Preparação do material vegetal e condições de crescimento Transplante in vitro de estacas de batata (Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta) de cultura de tecidos para vasos de 250 mL. Encha os vasos com o substrato Klasmman 2 totalmente saturado e mantenha-os na câmara de crescimento em condições de pouca luz por 1 semana. Ajuste as condições de luz no nível do dossel para 160 μmol·m-2·s-1 com uma combinação de 25% de luz branca e 35% de infravermelho usando um medidor de luz. Transplante as plantas após 10 dias de cultivo das estacas in vitro no solo para vasos de 3 L (15,5 cm de diâmetro, 20,5 cm de altura). Encha o pote de 3 L com 1850 g de Klasmann 3:1 Substrato 2: Areia. Coloque as plantas na câmara de crescimento sob condições de luz de 320 μmol · m-2 · s-1 com uma combinação de 55% de luz branca e 81% de infravermelho e defina-o para um regime de dia longo (fotoperíodo de 16 h). Defina a temperatura na câmara de crescimento para 22 °C / 19 ° C para dia / noite e a umidade relativa (UR) para 55% para todo o experimento. Manter o peso do vaso em 60% do teor relativo de água do solo (SRWC) como o nível de controle adequado para manter o crescimento e o rendimento30,31.NOTA: Com base em ensaios anteriores, a manutenção do teor volumétrico de água acima de 60% promoveu o crescimento de musgo na superfície do solo e elevou o risco de doenças nas plantas. Além disso, a presença de musgo pode gerar sinais positivos enganosos da imagem de fluorescência da clorofila, o que é difícil de filtrar. Use a seguinte equação: SRWC% = (FW-DW)/(TW-DW) × 100, onde FW é o peso fresco do solo, TW é o peso do turgor e DW é o peso seco32.Selecione as amostras de solo (100 g) de três sacos de mistura diferentes do substrato 2 de Klasmman como réplicas e pese o peso fresco do solo. Sature o solo com água até que os vasos retenham água sem pingar e pese o peso do turgor do solo. Colocar a amostra na estufa a 80 °C durante 3 dias até que as amostras de solo estejam completamente secas e pesar o peso seco do solo33. Coloque os tapetes azuis na superfície do pote para reduzir a evaporação.NOTA: A cor azul é necessária para subtrair o fundo do solo dos pixels da planta na segmentação da imagem. Selecione dez réplicas biológicas por tratamento. Randomize os vasos durante a irrigação (no total, 50 vasos). Adicione os suportes azuis para apoiar as plantas e evite danos mecânicos ao colocá-las no sistema de fenotipagem. 2. Aplicação de estresse No estágio inicial de tuberização (28 dias após o transplante das estacas in vitro ), divida as plantas em cinco grupos de tratamento e fenótipo dez plantas por tratamento (Figura 1). Induzir o estresse único e combinado a um nível que não seja prejudicial da seguinte forma:Na câmara de crescimento, manter as plantas sob controle, tratamentos de seca e encharcamento a 22 °C/19 °C dia/noite (etapa 1.7), com diferentes porcentagens de SRWC:Controle (C) com 60% de SRWC para todo o experimento.Seca (D) com 20% de SRWC gradualmente por 7 dias, seguido de 1 dia de recuperação.Alagamento (W) com 160% de SRWC por 5 dias, seguido de 10 dias de recuperação. Para manter o nível da água acima da superfície do solo no tratamento de alagamento, insira um saco plástico no vaso vazio e, em seguida, coloque o vaso principal com terra no segundo vaso preparado. Coloque as plantas em uma cápsula de crescimento a 30/28 °C dia/noite e 55% UR para tratamentos térmicos. Imponha tensões térmicas simples e combinadas da seguinte forma:Para Calor (H), mantenha a temperatura de 30-28 °C com 60% de SRWC por 15 dias. Para estresse triplo de Calor + Seca + Alagamento (HDW), exponha as plantas a tratamento térmico a 30 °C/28 °C de temperatura dia/noite nos primeiros 7 dias (mantendo 60% SRWC), seguido de tratamento combinado de seca + calor nos outros 7 dias (20% SRWC e 30 °C/28 °C) e, finalmente, exponha as plantas ao estresse de encharcamento por 1 dia. Para este último, coloque as plantas de volta na câmara de crescimento (consulte a etapa 1.7 para as condições) e induza o alagamento a 160% SRWC por 1 dia.NOTA: As durações selecionadas dos estresses induzidos foram baseadas em um experimento piloto que mostrou efeitos de estresse sem impactos prejudiciais com 100% de sobrevivência das plantas tratadas. No ambiente da câmara de crescimento, a variação das condições ambientais ficou na faixa ± 0,2 °C para temperatura e ± 3% para umidade. 3. Preparação da planta para fenotipagem Depois que as luzes forem acesas às 6:00 da manhã nas câmaras de crescimento, permita que as plantas se aclimatem sob as condições de luz de crescimento constante (320 μmol · m-2 · s-1) por pelo menos 2-3 h antes do início do protocolo de fenotipagem. Isso garante que a fotossíntese e a regulação estomática estejam em estado estacionário34. Antes da medição, transfira as plantas de seu local de cultivo para a área de buffer de crescimento do sistema de fenotipagem usado para carregamento manual de plantas no sistema enquanto a pontuação automatizada está em modo de espera e posicionada dentro da estufa (Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3).NOTA: As plantas foram mantidas na área do tampão de crescimento durante o período de fenotipagem com duração de 3,5 h. Na casa de vegetação, a variação das condições ambientais ficou na faixa de ± 2 °C para temperatura, ± 5% para umidade e 20% de flutuação na intensidade luminosa. Assim, considere que as medições devem começar imediatamente e ser curtas, evitando a influência das condições de estufa nas plantas. Na plataforma de fenotipagem, coloque os potes nos discos que se movem automaticamente em uma esteira transportadora em determinados intervalos para o sensor de imagem de acordo com os protocolos de medição especificados na seção 4. Rotule cada planta/bandeja com um ID exclusivo para garantir que os dados medidos sejam atribuídos à planta correta durante todo o experimento. 4. Protocolo de fenotipagem Otimize o protocolo de fenotipagem usando vários sensores de imagem (fluorescência de clorofila, IR térmico, RGB e imagem hiperespectral), permitindo assim a medição simultânea dos parâmetros fisiológicos e morfológicos das plantas (Figura 2).NOTA: Como as respostas das plantas refletem as condições ambientais e os efeitos diurnos, é importante considerar a randomização dos vasos e a realização da fenotipagem no mesmo período do dia. Na plataforma de fenotipagem, certifique-se de que as plantas entrem no sistema através de um túnel de adaptação (Figura 2A) onde a altura da planta é capturada primeiro e, em seguida, a altura de cada sensor é ajustada com base na distância de trabalho fixa. Realize as medições em duas rodadas, conforme justificado no protocolo de medição, usando o software.Na primeira rodada, compreendem as medidas de respostas fisiológicas quantificadas como “reações rápidas” usando fluorescência de clorofila e imagens térmicas. Comece medindo os parâmetros fisiológicos sob tratamentos de estresse térmico e depois o restante dos tratamentos. Na segunda rodada, prossiga com outras medições para avaliar respostas mais lentas, incluindo RGB estrutural e imagens hiperespectrais, seguidas de avaliação de peso e irrigação. Durante a etapa de pesagem e rega, defina o peso de referência para cada planta para permitir a rega e pesagem automatizadas para o tratamento fornecido.Certifique-se de que o peso total de referência inclua o peso do disco, inserção localizada na correia transportadora, suporte azul, tapete azul, vaso, solo e biomassa vegetal no protocolo definido. Para uma medição precisa da evapotranspiração durante a etapa de pesagem e rega, prepare potes vazios como referência. Além disso, prepare vasos adicionais para corrigir o peso da biomassa da planta. Para medir 50 plantas, toda a duração do protocolo de fenotipagem leva 215 min (85 min na1ª rodada e 130 min na2ª rodada). Fenótipo diariamente todas as plantas sob condições controle (1 dia antes do tratamento) e, em seguida, induzir os tratamentos de estresse para monitorar as respostas dinâmicas e avaliar as fases inicial e tardia do estresse induzido. 5. Ajustando as configurações para cada sensor de imagem Imagem de fluorescência cinética de clorofilaNOTA: A fluorescência cinética da clorofila é usada para investigar a capacidade fotossintética das plantas em resposta a diferentes condições ambientais, incluindo estresses abióticos, e para fornecer informações valiosas sobre a eficiência quântica da fotoquímica e dissipação de calor (processo não fotoquímico).Realizar a medição da fluorescência da clorofila em plantas adaptadas à luz usando um protocolo de luz curta para discriminar as respostas das plantas sob diferentes tratamentos. Aclimatar35 as plantas por 5 min sob a luz no túnel de adaptação equipado com LEDs branco-frios (6500 K) a 500 μmol·m-2·s-1.NOTA: A imagem de fluorescência da clorofila é a primeira medição após a adaptação à luz usada para monitorar as mudanças nas capacidades fotossintéticas das plantas. Selecione e otimize o protocolo pré-definido de acordo com o tamanho da planta e as intensidades de luz necessárias. Otimize as configurações de medição, incluindo configurações de câmera e intensidade de luz para garantir a aquisição de um sinal forte com uma relação sinal-ruído ideal.Ajuste as configurações da câmera, como obturador (tempo de exposição, duração dos flashes de medição) e sensibilidade (ganho elétrico da câmera). Use o obturador em 2 ms e sensibilidade em 12%.NOTA: Esses valores são ajustados com base no tamanho e forma da folha e na distância definida entre o topo do dossel e o sensor de imagem. Ajuste a intensidade da luz actínica em 500 μmol·m-2·s-1 e defina o pulso de saturação em 3200 μmol·m-2·s-1, que é pelo menos 6-7 vezes maior que a luz actínica. Para medir parâmetros em condições de luz em estado estacionário (Lss) (descritos abaixo), adapte à luz as plantas por 5 minutos antes das medições no túnel de adaptação à luz. Para estimar o rendimento quântico do fotossistema II (PSII) em estado estacionário de plantas adaptadas à luz, selecione o protocolo de luz curta (Figura 3) e defina o protocolo da seguinte forma.NOTA: A duração do protocolo foi de 10 s por planta.Inicie a medição ligando a luz actínica branca fria a 500 μmol·m-2·s-1 por 3 s para medir a fluorescência em estado estacionário na luz (Ft_Lss aka. Ft’) Aplique pulso de saturação a 3200 μmol·m-2·s-1 por 800 ms para medir a fluorescência máxima em estado estacionário na luz (Fm_Lss aka. Fm’) Desligue a luz actínica e, em seguida, acenda a luz vermelha distante (735 nm) para permitir que o PSII relaxe no escuro por 800 ms e meça a fluorescência mínima em estado estacionário na luz (Fo_Lss aka. Fo’). Para calcular os parâmetros relativos, use um software analisador de dados que subtraia o plano de fundo e extrai os parâmetros relevantes.NOTA: Os parâmetros extraídos do protocolo utilizado são: eficiência máxima da fotoquímica PSII da amostra adaptada à luz em estado estacionário de luz determinada como Fv/Fm_Lss aka. Fv’/Fm’, rendimento quântico do fotossistema II ou eficiência operacional do fotossistema II em estado estacionário de luz definido como QY_Lss aka. φPSII = Fq’/Fm’, e a fração de centros de reação abertos em PSII (QA oxidado) é determinada como qL_Lss = (Fq’/Fv’) x (F0’/Ft’). Imagens térmicas infravermelhas (IR)NOTA: A imagem IR térmica é usada para medição não invasiva da temperatura real do dossel, determinando assim os diferentes regulamentos estomáticos. Na unidade de imagem térmica IR, uma câmera térmica é montada lateralmente no braço robótico para medir a temperatura do dossel a partir da vista lateral.Para aumentar o contraste da temperatura de fundo sobre a temperatura do objeto fotografado durante o processamento da imagem, use uma parede aquecida controlada automaticamente no lado oposto da câmera térmica para aumentar o contraste. Regule a temperatura da parede a 8 °C acima da temperatura do ar na unidade de imagem.NOTA: As imagens térmicas foram adquiridas no escuro usando o modo de varredura de linha35. Após a aquisição da imagem, gere uma máscara de planta com base nos dados de visão lateral RGB e empregue-a para co-registrar com dados térmicos na análise da imagem. Isso garante a identificação precisa do objeto digitalizado, eliminando a interferência de fundo, como o suporte da planta. Para evitar a influência de condições ambientais flutuantes ao longo de todo o experimento, calcule a diferença de temperatura do parâmetro (delta T ou ΔT).NOTA: Delta T (ΔT) é definido como a diferença entre a temperatura medida da superfície da folha (a média de todos os pixels de toda a superfície detectada da planta) e a temperatura do ar ambiente dentro da caixa de imagem. Imagem RGBNOTA: A imagem RGB é baseada em câmeras do sistema visual inercial (VIS) que detectam luz na faixa visível de 400 a 700 nm, onde é usada para análise aprofundada da morfologia da planta, arquitetura e extração de características do índice de cores.A unidade de imagem contém uma mesa giratória para posicionamento preciso da bandeja e, simultaneamente, permite imagens em vários ângulos para vistas laterais. Defina a imagem RGB com base na imagem de vista lateral para capturar a planta de três ângulos (0°, 120° e 240°), que é tirada no modo de varredura de linha (RGB1) e na imagem de vista superior no modo de instantâneo (RGB2). Ambas as câmeras possuem uma fonte de luz baseada em LED, garantindo uma iluminação homogênea da planta fotografada e, assim, determinando com precisão as características morfológicas e de cor. Extraia parâmetros calculados usando o software analisador de dados. Para parâmetros adicionais baseados em vistas laterais e superiores, calcule o volume da planta (biomassa digital) 36 : Calcule a taxa de crescimento relativo (TCR)37:Onde Tn e Tn+1 indicam o intervalo de tempo (dias). Imagem hiperespectralNOTA: A imagem hiperespectral é usada para a visualização da refletância espectral das plantas. As mudanças na refletância foliar são indicadores dos diferentes estados fisiológicos da planta em questão.Use o sensor de imagem hiperespectral para quantificar a refletância do dossel na parte visível dos espectros de luz, com uma câmera hiperespectral de infravermelho próximo visível (VNIR) na faixa de 380-900 nm e uma câmera infravermelha de comprimento de onda curto (SWIR) na faixa de 900-1700 nm. As câmeras são montadas em um braço robótico com uma fonte de luz de tubo halógeno implementada (600 W) para iluminação de amostra homogênea e espectralmente apropriada durante a aquisição de imagens que se movem pela área XZ. Ambas as câmeras operam no modo de varredura de linha e são colocadas em uma caixa de imagem isolada com luz. Antes de cada rodada de medição, execute duas medições de calibração (automaticamente): calibração de corrente escura e calibração radiométrica usando o padrão Teflon de refletância espectral. A imagem de calibração escura é subtraída da imagem de calibração bruta e branca para remover o ruído de corrente escura. Em seguida, gere o hiperespectral final dividindo a imagem bruta após a subtração pela imagem de calibração branca. 6. Exportação de dados e análise de imagem Use o software analisador de dados para extração automática, subtração de fundo e segmentação Plant Mask do pipeline de processamento de imagem (Figura 2B). O software realiza uma análise totalmente automatizada onde a aplicação da máscara, a subtração de fundo na qual as plantas são isoladas de seu fundo e o cálculo de parâmetros são processados conforme descrito para imagens RGB38 e imagens térmicas20. Extraia os parâmetros medidos e calculados dos pixels específicos da planta, conforme definido pela máscara de planta e máscara de bandeja geradas por imagem RGB. Se as imagens não foram totalmente selecionadas, o que pode ocorrer devido a mudanças no verde da vegetação durante os estágios posteriores de desenvolvimento ou ao efeito do tratamento de estresse, abra a parte de análise de dados local no software e reajuste as configurações da máscara de planta no software analisador de dados dependendo de cada sensor. No processamento de imagens de fluorescência de clorofila, ajuste os parâmetros de análise de configurações da máscara de planta de fluorescência de clorofila (Figura Suplementar 4).Defina o limite como True, o que significa que a segmentação da planta é executada automaticamente. Defina o Índice do Quadro da Máscara como Falso, o que significa que, para a detecção da Máscara de Planta , o quadro Time-Visual é usado conforme definido no protocolo de fluorescência da clorofila. No processamento de imagens térmicas, defina os parâmetros para a análise da máscara de planta (Figura 5 suplementar).Defina o limite automático para a Geração de máscara de objeto como Falso. Defina a máscara da imagem lateral RGB como True para ser usada para análise. No processamento de imagens RGB, ajuste os parâmetros de análise das configurações da Máscara de Planta (Figura Suplementar 6 e Figura Suplementar 7) dependendo da espécie e do estágio de desenvolvimento.Selecione a fórmula 4*G-3*B-R, que é a definição para a geração de máscara de objeto e define o componente de cor usado (componente Vermelho, Verde, Azul).NOTA: Esta fórmula padrão e outras configurações podem mudar dependendo do tipo de câmera usada (visualização superior ou de tamanho), tratamento aplicado e diferentes cultivares. Ajuste o limite usado para conversão da imagem em tons de cinza com um canal verde aprimorado para uma imagem binária – determinando a superfície coberta pela planta. Ajuste o tamanho médio do filtro usado para reduzir o ruído e os pixels inválidos e preencha os ausentes. Ajuste o Tamanho mínimo do objeto em pixels a ser incluído na análise. Ajuste o tamanho mínimo dos furos nos objetos de máscara em pixels, normalmente dezenas de pixels. Os furos menores que esse valor são fechados e levados para os pixels do objeto. Defina Usar redução de reflexão como True para normalizar valores RGB em cada pixel. Defina Ignorar pontos expostos ruins como True para cortar acima/abaixo dos pixels expostos da máscara da planta (por exemplo, omissão dos reflexos da superfície ou dos pixels escuros onde o ruído é maior que o sinal). Colora as configurações de segmentação analisadas a partir do RGB usando o software analisador de dados para fornecer informações sobre mudanças de cor relacionadas às respostas ao estresse e à senescência da planta.NOTA: O verde é estimado usando uma gama predefinida de cores que representam todos os estágios de desenvolvimento da planta. A intensidade nos canais de cores de todos os pixels correspondentes à superfície da planta foi agrupada e agrupada para ser usada como um mapa de cores de origem para segmentação de cores.Forneça a imagem RGB processada (fundo removido), mapa de cores – lista de matizes para análise específica, como uma entrada no software. Para obter resultados imparciais, execute a seleção de matizes usando um conjunto de dados de “treinamento” e selecione diferentes estágios de desenvolvimento e tratamentos.NOTA: A análise salva os valores R, G e B de cada pixel de cada imagem deste conjunto de dados de treinamento. Defina o número de matizes (selecione 6 matizes) usando o software para a saída de definição de cores, variando de 0 a 255 para cada canal. Forneça a lista de matizes gerados no software analisador de dados (Cores). No processamento de imagens hiperespectrais, processe os dados hiperespectrais adquiridos usando a análise pixel a pixel implementada no software analisador hiperespectral, com calibração radiométrica e de ruído escuro, subtração de fundo e segmentação de máscara de planta. Use os espectros médios e os índices de vegetação para análises posteriores. Crie a máscara para extração de dados da imagem hiperespectral da imagem VNIR tirada pela câmera hiperespectral VNIR. Para a varredura hiperespectral SWIR, gere uma máscara de planta com base na análise SWIR.Em VNIR Plant Mask, use a fórmula 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) para visualizar as imagens em que R representa o valor de refletância em um comprimento de onda específico (Figura Suplementar 8). Na SWIR Plant Mask, use a fórmula (R960-R1450)-(R960-R1200) no processamento de imagens para visualizar as imagens (Figura Suplementar 9). 7. Pesagem e rega Armazene o peso (antes) de regar durante o procedimento de pesagem e rega. Em seguida, aplique a rega e mantenha o peso após a rega também. Regue as bandejas no modo de referência – cada bandeja tinha um valor de referência armazenado no banco de dados, para o qual era sempre regado. Determine a referência com base no tratamento. 8. Análise dos dados Analisar os dados por meio de ANOVA e teste de Shapiro. Realize comparações pareadas entre diferentes tratamentos pelo teste Pairwise Wilcox no R studio (versão 4.2.3) usando os pacotes (dplyr), (tidyverse), (rstatix) e (ggpubr).NOTA: A análise da imagem foi feita automaticamente usando o software analisador de dados. Para uma análise mais aprofundada da aquisição da imagem, use o software analisador de dados específico do sensor.

Representative Results

Neste estudo, a fenotipagem automatizada baseada em imagens foi usada para investigar as respostas morfológicas e fisiológicas da batata (cv. Lady Rosetta) sob estresse único e combinado. A abordagem aplicada mostrou as respostas dinâmicas das plantas em alta resolução espaço-temporal quando o estresse foi induzido no estágio de iniciação do tubérculo. Para avaliar as fases inicial e tardia do estresse, os resultados foram apresentados como 3 períodos de tempo ([0-5 dias de fenotipagem (DOP)], [6-10 DOP] e [11-15 DOP]) (Figura 1). Até 0 DOP, todas as plantas foram cultivadas sob condições de controle (C), depois de 1-5 DOP, onde foram aplicadas as tensões de encharcamento (W) e estresse térmico (H). Assim, as respostas foram observadas da seguinte forma: (i) em 0-5 DOP, indicaram o calor inicial e o alagamento; (ii) em 6-10 DOP, refletiu o início da seca (D) e foi observado calor e seca combinados (HD) e (iii) em 11-15 DOP, mostrou os estresses tardios de calor, seca e calor combinado + seca + encharcamento (HDW). A recuperação do alagamento foi observada em 6-10 DOP e 11-15 DOP. Características morfológicasA imagem RGB foi aplicada para determinar o efeito de diferentes tensões e combinações no crescimento das plantas acima do solo. Os resultados da Figura 4 mostram que o tratamento térmico e o estresse de encharcamento (0-5 DOP) já causam uma redução do volume da planta e da TCR em relação ao controle. Durante 6-10 DOP, o volume das plantas e a TCR das plantas controle aumentaram continuamente, enquanto sob calor, calor combinado, seca e alagamento, esse aumento no volume das plantas foi claramente reduzido (Figura 4A). Como as plantas são muito suscetíveis ao estresse de encharcamento, foi pronunciada uma diminuição na TCR (Figura 4B). Durante o estresse hídrico tardio (11-15 DOP), onde o SRWC foi mantido em 20%, foi observada uma clara redução na TCR em comparação com o controle. No entanto, na fase tardia da HDW combinada, a aplicação do tratamento de encharcamento causou um aumento na TCR no último dia de estresse. Traços fisiológicosA combinação de fenotipagem estrutural e fisiológica foi aplicada para revelar outras respostas ao estresse. O uso de vários sensores de imagem permite a determinação das respostas fisiológicas na fase inicial do estresse. Uma análise mais aprofundada dos dados de fluorescência da clorofila mostrou que o alagamento estava afetando negativamente a eficiência fotossintética onde Fv ‘/ Fm ‘(Fv / Fm_Lss) diminuiu drasticamente em 0-5 DOP e 6-10 DOP, mas uma resposta de recuperação foi observada em 11-15 DOP onde Fv ‘/ Fm’ aumentou ligeiramente ( Figura 5A ). Durante a fase de estresse tardio (11-15 DOP), foi observada uma redução de Fv’/Fm’ na seca e na combinação de calor e seca. Em plantas alagadas, a eficiência operacional das plantas (QY_Lss também conhecida como φPSII) foi significativamente menor em comparação com outros tratamentos em 0-5 DOP e 6-10 DOP, mas um ligeiro aumento em 11-15 DOP, indicando assim a recuperação da planta (Figura 5B). Além disso, os diferentes mecanismos de regulação da eficiência que contribuem para a proteção do PSII foram determinados calculando a fração de centros de reação abertos no PSII em um estado estacionário leve (qL_Lss) (Figura 5C). Somente sob a seca foi observado um aumento na qL, provavelmente devido à fotoinibição. Esses achados estavam de acordo com os dados de RI que refletiam diferentes mecanismos subjacentes sob tensões (Figura 6). Observou-se aumento do deltaT (ΔT) no alagamento, reduzindo a taxa de troca gasosa. Sob seca tardia e estresse combinado de calor e seca, um aumento no ΔT foi devido ao fechamento dos estômatos, considerado uma das principais respostas para evitar o excesso de perda de água. Por outro lado, observou-se uma redução no ΔT sob tratamentos térmicos à medida que os estômatos se abrem para aumentar a eficiência da transpiração e resfriar a superfície foliar. Ao investigar os dados hiperespectrais, dois parâmetros foram selecionados a partir dos dados VNIR hiperespectrais para avaliar os índices de refletância foliar, incluindo NDVI como indicador do teor de clorofila e PRI como indicador da eficiência da fotossíntese. Os resultados mostraram uma diminuição no NDVI e PRI apenas sob alagamento em conexão com a redução observada nas características morfológicas (Figura 7A,B). Além disso, a partir dos dados hiperespectrais SWIR usados para avaliar o teor de água nas plantas, foi observado um aumento no índice de água no alagamento durante 0-5 DOP (Figura 7C). No entanto, sob tratamentos térmicos, foi observada uma resposta oposta onde o índice de água foi menor que o controle. Esses achados estavam de acordo com um exame da vegetação a partir da segmentação de cores da vista superior RGB. As mudanças na proporção de matizes indicam as respostas ao estresse ao longo do tempo (Figura 8). O índice de greening mostrou uma redução no teor de pigmento sob seca e HDW combinado na fase de estresse tardio e recuperação gradual do tratamento de encharcamento. Assim, o uso de múltiplos sensores de imagem refletiu a correlação de características morfofisiológicas e permitiu a avaliação do desempenho geral da planta sob estresses abióticos. Figura 1: Linha do tempo de aplicação dos diferentes tratamentos, incluindo a idade das plantas em dias após o transplante das estacas in vitro . O dia 0 de fenotipagem (DOP) foi medido sob condições de controle (C) e, em seguida, os diferentes estresses foram induzidos com diferentes durações. De 1 a 5 DOP, foi aplicada a tensão de alagamento (W) e a resposta inicial do tratamento térmico (H). Nos dias seguintes, 6-10 DOP, onde foram apresentadas as fases iniciais do estresse hídrico (D) e estresse térmico e hídrico combinado (HD). Durante 11-15 DOP, refletiu-se a resposta das plantas à fase tardia de seca e tratamentos térmicos e a aplicação de encharcamento à HD (HDW) por 1 dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Esquema resumindo o protocolo de fenotipagem e análise de dados. (A) Visão geral do protocolo de fenotipagem. As plantas são transportadas para o sistema de fenotipagem a partir das condições controladas na câmara de crescimento FS-WI (PSI). As plantas foram aclimatadas à luz na câmara de adaptação à luz por 5 min a 500 μmol.m-2.s-1 antes das medições. Vários sensores de imagem foram usados para determinar as características morfológicas e fisiológicas, seguidos pela estação de pesagem e irrigação. Dependendo do tratamento, as plantas foram colocadas de volta em condições controladas, a 22 ° C / 19 ° C ou 30 ° C / 28 ° C. (B) Extração e segmentação automáticas da tubulação de processamento de imagem de cada sensor de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Visão geral do protocolo de luz curta para imagens de fluorescência de clorofila. O protocolo de medição começou ligando a luz actínica branca fria para medir a fluorescência em estado estacionário na luz (Ft_Lss) e, em seguida, aplicando um pulso de saturação para medir a fluorescência máxima em estado estacionário na luz (Fm_Lss). A luz actínica foi desligada e a luz vermelha distante foi ligada para determinar a fluorescência mínima em estado estacionário na luz (Fo_Lss). A duração do protocolo foi de 10 s por planta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Imagem RGB usada para avaliação morfológica. (A) Volume da planta calculado a partir da área de vistas superior e lateral RGB. (B) Taxa de crescimento relativo (TCR) durante a fase de iniciação do tubérculo. Os dados representam valores médios ± desvio padrão (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Imagem de fluorescência de clorofila em plantas adaptadas à luz. (A) Eficiência máxima da fotoquímica PSII da amostra adaptada à luz em estado estacionário de luz (Fv / Fm_Lss). (B) Rendimento quântico do fotossistema II ou eficiência operacional do fotossistema II em estado estacionário leve (QY_Lss). (C) Fração de centros de reação abertos em PSII em estado estacionário leve (QA oxidado) (qL_Lss). Os dados representam valores médios ± desvio padrão (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: A imagem de infravermelho térmico foi usada para calcular a diferença entre a temperatura média do dossel extraída das imagens de infravermelho térmico e a temperatura do ar (ΔT). Os dados representam valores médios ± desvio padrão (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Imagem hiperespectral para determinar índices de vegetação e conteúdo de água. (A) Índice de Vegetação por Diferença Normalizada (NDVI). (B) Índice de refletância fotoquímica (PRI) calculado a partir de imagens VNIR. (C) Índice de água calculado a partir de imagens SWIR. Os dados representam valores médios ± desvio padrão (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Índice de greening para plantas sob diferentes tratamentos. O processamento da imagem é baseado na transformação da imagem RGB original em um mapa de cores composto por 6 matizes definidos. Os dados representam valores médios ± desvio padrão (n = 10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura suplementar 1: Intensidade da luz medida durante os dias de fenotipagem (DOP). A duração das medições das 9h00 às 12h35. LI_Buff refere-se aos dados medianos de 5 sensores de luz distribuídos na estufa. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 2: Umidade relativa (UR) medida durante os dias de fenotipagem (DOP). A duração das medições das 9h00 às 12h35. RH_Buff refere-se aos dados medianos de 5 sensores de umidade distribuídos na estufa. RH2 refere-se à umidade relativa na câmara de adaptação. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura 3 suplementar: Temperatura medida durante os dias de fenotipagem (DOP). A duração das medições das 9h00 às 12h35. T_Buff refere-se aos dados medianos de 5 sensores de temperatura distribuídos na estufa. T2 refere-se à temperatura na câmara de adaptação. T3 refere-se à temperatura da parede de aquecimento. T4 refere-se à temperatura na unidade de imagem térmica IR. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura suplementar 4: Captura de tela do software analisador de dados mostrando os parâmetros ajustados para análise de máscara de planta em sensores de imagem de fluorescência de clorofila. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura 5 suplementar: Captura de tela do software analisador de dados mostrando os parâmetros ajustados para análise de máscara de planta em sensores de imagem infravermelho térmico. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura 6 suplementar: Captura de tela do software analisador de dados mostrando os parâmetros ajustados para análise de máscara de planta em sensores de imagem RGB de 1 lado. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura 7 suplementar: Captura de tela do software analisador de dados mostrando os parâmetros ajustados para análise de máscara de planta em sensores de imagem de visão superior RGB2. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura 8 suplementar: Captura de tela do software analisador de dados mostrando os parâmetros ajustados para análise de máscara de planta em sensores de imagem VNIR. Clique aqui para baixar este arquivo. Figura 9 suplementar: Captura de tela do software analisador de dados mostrando os parâmetros ajustados para análise de máscara de planta em sensores de imagem SWIR. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Ferramentas avançadas de imagem de alta resolução aprimoradas e técnicas de visão computacional permitiram o rápido desenvolvimento da fenotipagem de plantas para obter dados quantitativos de imagens massivas de plantas de maneira reprodutível³⁹. Este estudo teve como objetivo adaptar e otimizar a metodologia baseada em imagens de alto rendimento usando uma série de sensores de imagem atualmente disponíveis para monitorar as respostas dinâmicas de plantas sob estresses abióticos únicos e combinados. Algumas etapas críticas da abordagem aplicada requerem ajustes, incluindo a aplicação de tensão e a seleção de um protocolo de imagem adequado para as medições. O uso de vários sensores para aquisição de imagens permite a quantificação de características fenotípicas importantes (como crescimento da planta, eficiência fotossintética, regulações estomáticas, refletância foliar, etc.). Além disso, melhora a compreensão de como as plantas de batata respondem a diferentes estresses abióticos. Este é um pré-requisito fundamental para acelerar projetos de melhoramento de plantas para desenvolver genótipos tolerantes ao clima⁴⁰. As respostas morfológicas ao estresse induzido dependem do estágio de desenvolvimento. Por exemplo, induzir estresse no estágio de iniciação do estolão ou tubérculo inibe o desenvolvimento de folhas e plantas e limita o número de estolões, reduzindo assim o rendimento final⁴¹. No entanto, em condições desfavoráveis, as plantas utilizam respostas ao estresse como uma resposta adaptativa para prevenir e reparar danos celulares induzidos pelo estresse⁴². As plantas têm mecanismos adaptativos para evitar e tolerar condições de estresse, dependendo do nível de severidade⁴³.

Compreender os mecanismos das plantas, induzir a duração e intensidade adequadas do estresse e determinar as respostas das plantas ao estresse usando sensores de imagem é considerado uma das etapas críticas. Quando várias tensões coincidem, a intensidade de uma tensão pode anular o efeito das outras, dependendo da combinação, intensidade e duração das tensões. Assim, os efeitos do estresse podem se somar ou respostas opostas podem (parcialmente) se cancelar, resultando em efeitos positivos ou negativos nas plantas. O protocolo selecionado neste estudo foi baseado em experiências anteriores para garantir que níveis de estresse suficientes fossem aplicados. Por exemplo, a aplicação do estresse hídrico foi ajustada para um nível moderado, como em um experimento anterior, a resposta não foi diferente dos tratamentos de controle em um estágio inicial de estresse com base na imagem de fluorescência da clorofila. Isso se deve à ocorrência de fotorrespiração que atua como um sumidouro alternativo para elétrons na membrana tilacóide e um mecanismo de proteção para o fotossistema II^44,45. Sob a resposta combinada ao estresse, a exposição da planta a um estressor primário leve pode aumentar a tolerância a um estressor seguinte, o que pode ter um impacto benéfico ou prejudicial⁴⁶. Neste estudo, uma resposta mais forte foi observada sob estresse combinado em comparação com o estresse hídrico individual. Ao investigar outras respostas fisiológicas, os resultados mostraram um aumento no ΔT (deltaT) sob seca à medida que os estômatos se fecham para evitar o excesso de perda de água. Em contraste, a resposta reversa foi observada sob estresse térmico, onde ΔT foi menor em comparação com o controle, refletindo a abertura dos estômatos para melhorar o resfriamento das folhas, de acordo com os achados no trigo sob estresse combinado de calor e seca²⁰. Durante o alagamento, o aumento de ΔT devido ao fechamento estomático resultou da deficiência de oxigênio no solo e da interrupção da homeostase da água radicular, diminuindo assim o fluxo de transpiração com um aumento no ABA, um hormônio chave nas respostas ao estresse hídrico⁴⁷.

Em estudos de estresse de plantas, a duração do estresse e os tratamentos de recuperação subsequentes são diretamente proporcionais à intensidade do estresse. Por exemplo, o estresse hídrico moderado, como manter a umidade do solo em 20% da capacidade de campo (FC), induz mudanças fenotípicas reversíveis que normalmente se recuperam após um único dia de reirrigação. Em contraste, condições severas de estresse, como alagamento, resultam em extensos danos fenotípicos, necessitando de um período de recuperação mais longo. Embora a padronização das durações dos tratamentos seja ideal, a variabilidade inerente nas intensidades de tensão deve ser levada em conta no projeto experimental.

A segunda etapa crítica é selecionar um protocolo apropriado e otimizar as configurações para cada sensor. A fluorescência da clorofila é uma ferramenta poderosa na determinação do desempenho de aparelhos fotossintéticos sob estresse⁴⁸. Diferentes protocolos de medição de fluorescência de clorofila podem ser selecionados com plantas adaptadas à luz ou ao escuro, dependendo da questão de pesquisa e do projeto experimental⁴⁹. Neste estudo, o protocolo selecionado (resposta à luz curta) permite a determinação de vários caracteres, incluindo F_v‘/F_m‘, φ_PSII e qL, que indicam o desempenho da fotossíntese em diferentes condições⁵⁰. Estudos anteriores mostraram que o protocolo utilizado na fenotipagem de alto rendimento é eficaz na investigação da eficiência fotossintética de plantas sob diferentes aplicações de tratamentos de estresse e na discriminação entre plantas saudáveis e estressadas^14,20. Com base no desenho experimental, é muito importante considerar a duração do protocolo selecionado ao medir em um sistema de alto rendimento com uma alta população de plantas. Assim, a medição da fluorescência da clorofila em plantas adaptadas à luz usando um protocolo de curto prazo foi selecionada para discriminar as respostas sob diferentes tratamentos. As interações genótipo-ambiente podem influenciar muitas características fenotípicas, o que é crítico durante a medição¹². É essencial considerar que a duração da medição deve ser concluída em um curto espaço de tempo para minimizar o efeito diurno nas limitações fotossintéticas⁵¹.

A imagem térmica IR foi usada para determinar a temperatura do dossel e entender a regulação estomática sob diferentes tratamentos⁵². Vale ressaltar que foi utilizada a otimização tecnológica onde a parede de aquecimento estava localizada no lado oposto da câmera, e a temperatura da parede era controlada dinamicamente e programável. Assim, é necessário ajustar a parede aquecida de fundo com sensores ambientais integrados para selecionar adequadamente as plantas do fundo, aumentando o contraste da temperatura de fundo sobre a temperatura do objeto fotografado.

Embora a análise de imagens seja automatizada, o ajuste dos índices de limite RGB ainda é necessário para obter uma máscara binária adequada na imagem RGB para selecionar plantas^{com precisão 53}. Além disso, a escolha de vários ângulos é importante para estimar adequadamente os parâmetros quantitativos, incluindo biomassa digital e taxa de crescimento. Neste estudo, três ângulos (0°, 120° e 240°) na vista lateral RGB foram selecionados e calculados para calcular o volume da planta e a taxa de crescimento relativo com precisão.

Dependendo da faixa espectral, muitos traços fisiológicos podem ser investigados usando imagens hiperespectrais⁵⁴. É necessário determinar qual dos índices de reflectância fornece as informações necessárias e mostra a resposta das plantas em diferentes condições¹⁴. É altamente exigido na triagem de variedades tolerantes e na fenotipagem de plantas para determinar a correlação entre os índices hiperespectrais e outras características fisiológicas⁵⁵. Neste estudo, as plantas sob tratamento de encharcamento mostraram uma resposta pronunciada no teor de clorofila e eficiência fotossintética a partir da imagem VNIR. Além disso, diferentes respostas foram observadas no índice de água calculado a partir da imagem SWIR sob tratamentos térmicos e encharcamento devido a diferentes regulações estomáticas e teor de água nas folhas.

Assim, essas descobertas destacam a utilidade de tal abordagem após a otimização das configurações e o potencial de usar vários sensores para encontrar características de estresse relevantes para a tolerância climática. A avaliação da dinâmica das respostas usando vários sensores de imagem pode ser usada como uma das ferramentas poderosas para melhorar os programas de melhoramento.

Materials

1.1” CMOS Sensor with RGB camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	The sensor delivers a resolution of 4112 × 4168 pixels for side view and 2560 × 1920 pixels for top view. The sensor is extremely sensitive and is a real megapixel CCD replacement and produces sharp, low-noise images
FluorCam	PSI, Drásov, Czech Republic	FC1300/8080-15	Pulse amplitude modulated (PAM) chlorophyll fluorometer
Fluorcam 10 software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.18106	For Chlorophyll fluorescence images visualization and analysis
GigE PSI RGB – 12.36 Megapixels Camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	For the side view projections, line scan mode was used with a resolution of 4112 px/line, 200 lines per second. The imaged area from the side view was 1205 × 1005 mm (height × width), while the imaged area from the top view position was 800 × 800 mm.
Hyperspectral Analyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.14	For hyperspectral images visualization and analysis
Hyperspectral camera HC-900 Series	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Visible-near-infrared (VNIR) camera 380-900 nm with a spectral resolution of 0.8 nm FWHM
Hyperspectral camera SWIR1700	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Short-wavelength infrared camera (SWIR) camera 900 – 1700 nm with a spectral resolution of 2 nm FWHM
InfraTec thermal camera (VarioCam HEAD 820(800))	Flir,  United States	https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/	Resolution of 1024 × 768 pixels, thermal sensitivity of < 20 mK and thermal emissivity value set default to 0.95.  with a scanning speed of 30 Hz and each line consisting of 768 pixels. The imaged area was 1205 × 1005 mm (height × width).
LED panel	PSI, Drásov, Czech Republic	https://led-growing-lights.com/products/	Equipped with 4 × 240 red-orange (618 nm), 120 cool-white LEDs (6500 K) and 240 far-red LEDs (735 nm) distributed equally over an imaging area of 80 × 80 cm
Light, temperature and relative humidity sensors	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	Sensors used to monitor controlled conditions in greenhouse
MEGASTOP Blue mats	Friedola	75831	To cover soil surface
Morphoanalyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.9.8	For RGB images visualization and analysis and color segmentation analysis
PlantScreen Data Analyzer software (Version 3.3.17.0)	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	To visualize and analyze the data from all imaging sensors,  watering-weighing unit and environmental conditions in greenhouse
PlantScreen Modular system	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Type of phenotyping platform
Plantscreen Scheduler software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 2.6.8368.25987	To plan the experiment and set the measuring protocol
SpectraPen MINI	PSI, Drásov, Czech Republic	https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details	Light meter to adjust light level on a canopy level
TOMI-2 high-resolution camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/	Resolution of 1360 × 1024 pixels, frame rate 20 fps and 16-bit depth) with a 7-position filter wheel is mounted on a robotic arm positioned in the middle of the multi-color LED light panel with dimensions of 1326 x 1586 mm.
Walk-in FytoScope growth chamber	PSI, Drásov, Czech Republic	https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/	Type of chambers used to grow the plant