Estimativa da Sensibilidade Estrutural de Regiões Intrinsecamente Desordenadas em Resposta ao Estresse Hiperosmótico em Células Vivas Utilizando FRET
Summary
Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são domínios proteicos flexíveis que modificam sua conformação em resposta a mudanças ambientais. A transferência de energia por ressonância de fluorescência em conjunto (FRET) pode estimar as dimensões da proteína sob diferentes condições. Apresentamos uma abordagem FRET para avaliar a sensibilidade estrutural da IDR em células vivas de Saccharomyces cerevisiae sob estresse hiperosmótico.
Abstract
Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são domínios proteicos que participam de processos celulares cruciais. Durante as condições de estresse, as propriedades físico-químicas do ambiente celular mudam, impactando diretamente o conjunto conformacional das IDRs. As IDRs são inerentemente sensíveis a perturbações ambientais. Estudar como as propriedades físico-químicas da célula regulam o conjunto conformacional de IDRs é essencial para a compreensão do controle ambiental de sua função. Aqui, descrevemos um método passo-a-passo para medir a sensibilidade estrutural de IDRs em células vivas de Saccharomyces cerevisiae em resposta a condições de estresse hiperosmótico. Apresentamos o uso da transferência de energia por ressonância de fluorescência de conjunto (FRET) para estimar como as dimensões globais das IDRs mudam durante um aumento progressivo do estresse hiperosmótico imposto às células com qualquer osmólito. Além disso, fornecemos um script para processar medições de fluorescência e comparar a sensibilidade estrutural para diferentes IDRs. Seguindo esse método, os pesquisadores podem obter informações valiosas sobre as mudanças conformacionais que as IDRs sofrem no complexo meio intracelular ao mudar ambientes.
Introduction
Regiões intrinsecamente desordenadas (IDRs) são componentes críticos nos processos celulares1. Em combinação com domínios estruturados, as IDRs são essenciais para as funções proteicas. A composição de aminoácidos das IDRs é tendenciosa, representada principalmente por resíduos carregados, hidrofílicos e pequenos. Devido a essa propriedade, os IDRs são considerados domínios de baixa complexidade 2,3. Numerosas IDRs têm chamado a atenção, principalmente porque essas regiões desempenham um papel crucial em condições patológicas, particularmente doenças neurodegenerativas. Tais doenças caracterizam-se pela automontagem e subsequente deposição extracelular ou intracelular de IDRs nosneurônios4. Exemplos dessas IDRs incluem β amiloide (Aβ) na doença de Alzheimer, huntingtina (HTT) na doença de Huntington e proteína ligadora de DNA TAR-43 (TDP-43) e fusionadas em sarcoma (FUS) na esclerose lateral amiotrófica e demência frontotemporal4. O estudo dos rearranjos estruturais das IDRs no contexto da doença tem sido significativamente aprimorado por métodos espectroscópicos, incluindo a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET).
A natureza hidrofílica e estendida das IDRs as torna extremamente sensíveis a mudanças nas propriedades físico-químicas do ambiente de solução5. O grau pelo qual o conjunto conformacional das IDRs é modificado pelo ambiente é chamado de sensibilidade estrutural 5,6,7. Diferentes técnicas podem ser utilizadas para estudar a conformação e a dinâmica das IDRs, incluindo dicroísmo circular (CD) e espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS)8,9. Infelizmente, CD e SAXS requerem grandes quantidades de proteínas purificadas, por isso não são apropriados para estudos em células. Em contraste, o FRET é uma técnica que mede a intensidade de fluorescência de duas moléculas fluorescentes que marcam especificamente uma IDR, o que significa que elas podem ser monitoradas em misturas complexas, como células vivas10. Medir dinamicamente a sensibilidade estrutural das IDRs em células vivas é necessário para entender como o ambiente regula a conformação e a função do proteoma desordenado.
FRET é um método poderoso para quantificar a sensibilidade estrutural de IDRs, bem como proteínas globulares e multidomínios em células vivas. O método requer uma construção que consiste em um IDR de interesse prensado entre duas proteínas fluorescentes (FP), conhecido como par FET. Para esse protocolo, sugerimos o uso de mCerulean3 como FP doador e Citrino como PF receptor, devido à sua grande faixa dinâmica, em comparação com outros FPs relatados em estudo anterior sobre sensibilidade dasRRD6. O FRET já foi explorado para medir a sensibilidade estrutural de uma planta IDR em diferentes contextos celulares6. Além disso, essa técnica tem sido utilizada para caracterizar as dimensões proteicas globais das IDRs por diferentes grupos de pesquisa, tanto in vitro quanto in vivo5,11.
Aqui, descrevemos o método de FRET de conjunto para estudar a sensibilidade estrutural de IDRs em células de levedura viva (Saccharomyces cerevisiae). Mostramos resultados representativos que são baseados em uma planta IDR chamada AtLEA4-5. AtLEA4-5 é desordenado em solução, mas dobra-se em α-hélice quando o apinhamento macromolecular é induzido in vitro12. O AtLEA4-5 é um bom modelo de referência para esse método por ser relativamente pequeno (158 resíduos), desordenado e sensível a perturbações ambientais, como relatado in silico e in vitro6,12. O método apresentado aqui pode ser dimensionado para abordagens de alto rendimento, pois as células de levedura são fáceis de cultivar, e o tratamento é aplicado em pequenos volumes. Além disso, pequenas modificações no protocolo podem ser aplicadas a outros sistemas celulares, como bactérias e célulasvegetais6. O protocolo pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia molecular com acesso a um leitor de microplacas com modo fluorescência, equipamento disponível na maioria das instituições de pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método apresentado aqui oferece uma maneira de obter insights sobre como as dimensões globais do conjunto de IDRs sentem e respondem a perturbações ambientais. Este método baseia-se em uma construção geneticamente codificada e não requer componentes adicionais além de uma expressão estável de plasmídio em células de levedura, tornando-o adaptável para aplicações potenciais em outros tipos celulares. Além disso, é versátil para explorar outras perturbações físico-químicas que as células eucariót…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do laboratório Cuevas-Velazquez pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto IA203422 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT); Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), projeto número 252952; e Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) e CAPD (CVU 1269643) reconhecem a CONAHCYT por sua bolsa de M.Sc.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
Referenzen
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