In-vitro血栓溶解モデルにおけるせん断流下におけるChandler Loop形成全血栓の線維素溶解の追跡
Summary
in vitro血栓溶解アッセイは、消化されるモデル血栓や血栓溶解が起こっている環境など、生体内条件を再現するのに苦労することがよくありました。ここでは、ChandlerループとReal-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF)の結合が、高忠実度のex-vivo血栓溶解モニタリングにどのように使用されているかを探ります。
Abstract
血栓塞栓症および関連する合併症は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因であり、 in vitro と in vivo の両方で血栓溶解薬の有効性をテストするためのさまざまなアッセイが開発されています。動物モデルには複雑性とコストがかかることに加え、ヒトの生理機能への翻訳性が欠如していることが多いことから、医薬品開発のためのより生理学的に関連性のある in-vitro 血栓モデルに対する需要が高まっています。流量、圧力、およびせん断速度は循環器系の重要な特性であり、流れの下で形成される血栓は、静的に形成された血栓とは異なる形態と消化特性を示します。これらの因子は、従来の in-vitro 血栓消化アッセイでは表現されないことが多く、薬物の翻訳成功率に影響を与える薬理学的な意味を持つ可能性があります。
Real-T ime Flu造山運動法 Flowing F線溶 (RT-FluFF) アッセイは、せん断流下で形成された蛍光タグ付き血栓を使用し、線維素溶解薬の有無下で循環プラズマを使用して消化する高忠実度の血栓溶解試験プラットフォームとして開発されました。血栓形成と血栓消化ステップの両方の流速を変更することで、システムは非常に多様な実験設定で動脈、肺、静脈の状態を模倣することができます。測定は、インライン蛍光光度計を使用するか、離散的な時間点を取ることによって連続的に行うことができ、従来のエンドポイントの血栓質量測定も可能です。RT-FluFFアッセイは、in-vitro試験システムの制御性と再現性を維持しながら、in-vivoの生理学的条件をより正確に表現する流条件下での血餅消化のリアルタイム追跡を可能にする柔軟なシステムです。
Introduction
基本的に血栓塞栓症の病因に起因する疾患は、現代社会における罹患率と死亡率の主要な原因を示しています。血栓塞栓症の病因の徴候には、心筋梗塞、虚血性脳卒中、深部静脈血栓症、および肺塞栓1が含まれるが、これらに限定されない。病原性血栓症に対処するための安全で効果的な方法の開発を中心に、複数の分野にまたがる膨大な量の進行中の研究が展開されています。血栓症の動脈および静脈の症状の変動と解剖学的位置の変動により、さまざまな治療アプローチが開発されました。ただし、急性期の治療は一般に、プラスミノーゲン活性化剤を介した薬理学的血栓溶解の使用に依存しており、特定の臨床状況下で機械的血栓摘出術の可能性があります2。
新しい薬理学的治療戦略の開発は、基本的に前臨床試験のためのinvivo動物モデルとinvitro消化モデルの両方に依存しています3,4。In-vivoモデルは、医薬品のクリアランスや薬物との細胞相互作用など、治療効果に関するさまざまな生理学的パラメータの複雑な相互作用を捉える能力から自然に恩恵を受けます。しかし、この同じ複雑さにより、このようなモデルは非常に高価になることが多く、ヒトの生理機能とは大きく異なる動物の基礎となる薬力学/動態を分離しようとすると、追加の問題が発生します。インビトロモデルの開発は、医薬品の開発とスクリーニングを実施できる蒸留試験環境を促進するのに役立ちましたが、多くの場合、研究対象の疾患状態を再現するために必要な忠実度に欠けています。
新規血栓溶解薬を試験するための一般的に見られるinvitroプロトコルは、残留血栓質量が主要評価項目5,6として機能する静的条件下で形成および溶解された血栓の利用に依存しています。残念ながら、このような手法では、乱流や経血栓圧力降下など、試験薬の薬力学を大きく変える可能性のある血栓溶解の機械的側面を説明できていません。さらに、静的条件下で形成された血栓には、生理学的血栓とは異なるマイクロアーキテクチャが含まれています。血栓形成中のせん断の存在は、血小板の活性化やフィブリン架橋など、結果として生じる血餅の特性に影響を与えることが再現性よく示されています。せん断流下で生成される血餅は、静的に形成された血餅7,8にはない、先端から尾までの複雑な不均一性を示します。このような生理学的血栓構造からの逸脱は、血栓内への薬物浸透とその後の溶解効率を含む重要な医薬品開発の特性評価に影響を与える可能性があります9。
静的凝固/血栓溶解モデルの使用に関連するこれらの制限のいくつかに対処するために、血栓形成とせん断の存在下での血栓溶解の両方にチャンドラーループを採用することで、復活が見られました10。このようなシステムは、比較的静的なアッセイと比較して、流れのダイナミクスをより適切に表現し、より生理学的に関連性のあるアーキテクチャの血栓を生成することができますが、その単純化された流れ条件は依然として生理学的条件からの逸脱を表しています。最後に、イメージングの容易さと均一なフローパターンにより、マイクロ流体アプローチも実施されています。しかし、それらは、主に臨床的に関連する血栓塞栓症11,12で影響を受けるより大きな血管内で予想される生理学的条件からの有意な除去のままです。
上記の議論を念頭に置いて、前臨床血栓溶解薬スクリーニングのための高忠実度の in-vitro 血栓溶解モデルを開発しました。このモデルは、新規血栓溶解療法スクリーニングの領域で上記で詳述した現在の落とし穴のいくつかに対処することを目的としており、さまざまな濃度の組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)での再現性と感度が検証されました。本明細書に記載のシステムは、蠕動ポンプ、圧力減衰器、加熱リザーバー、2つの圧力センサ、インライン蛍光計、および蛍光標識されたチャンドラーループせん断形成血餅アナログを利用して生理学的せん断流を提供し、線維素溶解13のリアルタイム追跡を容易にする。まとめると、システム全体は Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay(RT-FluFF Assay)14 と呼ばれ、この原稿では、この高忠実度の in-vitro 血栓溶解モデルでアッセイを正常にセットアップして実行するための複雑さについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
血栓の形成と標識
チャンドラーループは、 生体内 血栓16を模倣する血栓を再現性よく生成する容易かつ効果的な手段を提供することが実証されている。チューブのサイズ、回転速度、ドラムの直径、凝固時間などのパラメータを微調整することで、動脈と静脈の両方の源を模倣したさまざまな血栓で評価される建築的特徴を捉えることができる、さま…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究は、米国国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所(National Heart, Lung, and Blood Institute)の賞番号R01HL167877で支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| 30 G Disposable Hypodermic Needles | Exel International | 26439 | Other Consumables |
| 6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long | uxcell | B07SXGSQ82 | Chandler loop, |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Apparatus , dampeners |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Calcium Chloride | Millipore Sigma | C5670 | Other Consumables |
| Disposable BP Transducers | AD Instruments | MLT0670 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans HemoMed Pod | Drager | 5588822 | RT-FluFF Apparatus |
| Drager Siemans Patient Monitor | Drager | SC 7000 | RT-FluFF Apparatus |
| Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm) | Chandler loop, | ||
| Face Shield | Moxe | SHIELDS10 | Chandler loop, |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Scientific | F13191 | Other Consumables |
| Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile | Masterflex | 30600-04 | RT-FluFF Apparatus |
| Fluorescein (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Other Consumables |
| General-Purpose Water Bath | Thermo Scientific | 2839 | Chandler loop, |
| Hotplate 4 × 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF Apparatus |
| Human Source Plasma Fresh-Frozen | Zen-Bio | SER-SPL | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| Human Whole Blood | Zen-Bio | SER-WB-SDS | Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant |
| L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Apparatus, Pump Head |
| L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FluFF Apparatus, Pump |
| Motor Speed Controller | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Apparatus |
| Peristaltic pump tubing | Masterflex | 06424-15 | Other Consumables |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection) | Molecular Devices | M5 | RT-FluFF Apparatus |
| Switching Power Supply | SoulBay | UC03U | Chandler loop, |
| Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Other Consumables |
| Tissue plasminogen activator, human | Millipore Sigma | T0831 | Other Consumables |
| Tubing ID 1/4'', OD 3/8'' | Fisher Scientific | AGL00017 | Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors |
| Tubing ID 5/32", OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 | Other Consumables |
| V3 365 nm Mini – Black Light UV Flashlight | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Chandler loop, used to check completed clots |
| ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm | Pangyoo | ZGA37RG | Chandler loop, |
Referenzen
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