Diferenciación y caracterización de osteoclastos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas
Summary
Este protocolo presenta la diferenciación de osteoclastos humanos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y describe métodos para la caracterización de osteoclastos y precursores de osteoclastos.
Abstract
Este protocolo detalla la propagación y el paso de las iPSCs humanas y su diferenciación en osteoclastos. En primer lugar, las iPSC se disocian en una suspensión unicelular para su posterior uso en la inducción de cuerpos embrioides. Después de la inducción mesodérmica, los cuerpos embrioides experimentan diferenciación hematopoyética, produciendo una población flotante de células hematopoyéticas. Posteriormente, las células hematopoyéticas recolectadas se someten a una etapa de maduración del factor estimulante de colonias de macrófagos y, finalmente, a la diferenciación de osteoclastos. Después de la diferenciación de los osteoclastos, los osteoclastos se caracterizan por la tinción de TRAP junto con una tinción nuclear de verde de metilo. Los osteoclastos se observan como policariones multinucleados TRAP+. Su identificación puede ser respaldada por la tinción de catepsina K. Los ensayos de reabsorción ósea y mineral permiten la caracterización funcional, confirmando la identidad de los osteoclastos de buena fe. Este protocolo demuestra un método robusto y versátil para diferenciar los osteoclastos humanos de las iPSC y permite una fácil adopción en aplicaciones que requieren grandes cantidades de osteoclastos humanos funcionales. Se podrían prever aplicaciones en las áreas de investigación ósea, investigación del cáncer, ingeniería de tejidos e investigación de endoprótesis.
Introduction
Los osteoclastos (OC) son tipos celulares versátiles derivados de hematopoyéticos 1,2 que son comúnmente utilizados por los investigadores en áreas como la investigación de enfermedades óseas 3,4, la investigación del cáncer 5,6, la ingeniería de tejidos 7,8 y la investigación de endoprótesis 9,10. Sin embargo, la diferenciación de los CO puede ser un reto, ya que la fusión de precursores mononucleares en CO multinucleados es necesaria para crear OC funcionales11. Varios factores biológicos, como el activador del receptor del ligando NF-κB (RANKL) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), son necesarios para la diferenciación del CO. Se ha reportado que M-CSF tiene un efecto positivo sobre la proliferación celular, la supervivencia celular y la expresión de RANK 12,13,14. Por otro lado, RANKL se une a RANK, que activa cascadas de señalización aguas abajo que inducen osteoclastogénesis. La activación está mediada por el factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), que conduce a la degradación del factor nuclear del potenciador del gen del polipéptido de luz kappa en el inhibidor de células B, alfa (IκB-α), una proteína de unión que se une a los dímeros NF-kB16,17. Por lo tanto, la degradación de IκB-α libera dímeros NF-kB, que luego se translocan al núcleo e inducen la expresión de los factores de transcripción c-Fos y el factor nuclear de las células T activadas 1 (NFATc1). Esto, a su vez, desencadena la transcripción de una multitud de proteínas relacionadas con la diferenciación de OC15,18. Las proteínas reguladas al alza, como DC-Stamp y Atp6v0d2, median la fusión célula-célula de los precursores de OC, lo que conduce a la formación de sincitio 19,20,21.
Con respecto a las células primarias humanas, las PBMC CD34+ y CD14+ son actualmente los tipos celulares más utilizados para la diferenciación en OC22. Sin embargo, este enfoque está limitado por la heterogeneidad dentro de la población CD34+ de células recolectadas de donantes23 y su limitada capacidad de expansión. Las iPSC humanas presentan una fuente alternativa para los AO. Como pueden propagarse indefinidamente24, permiten la capacidad de expansión y el aumento de la producción de CO. Esto permite la diferenciación de un gran número de CO, lo que facilita la investigación de CO.
Se han publicado varios protocolos para la diferenciación de las iPSC en CO 25,26,27. Todo el proceso de diferenciación se puede dividir en una parte de propagación de iPSC, una parte de diferenciación mesodérmica y hematopoyética, y una diferenciación de OC. La propagación de iPSCs antes del proceso de diferenciación permite aumentar la producción de CO antes de la diferenciación. Existen varios enfoques con respecto a la diferenciación mesodérmica y hematopoyética. Tradicionalmente, la formación de cuerpos embrioides (EB) se ha utilizado para diferenciar las células hematopoyéticas, pero los enfoques basados en monocapas representan otra estrategia de diferenciación hematopoyética que no requiere la inducción de EB. Sin embargo, los sistemas basados en monocapa parecen requerir una mayor optimización, ya que nosotros y otros hemos encontrado que los enfoques basados en EB son más robustos para la diferenciación de los CO.
Aquí, describimos la diferenciación de los OC de las iPSC humanas utilizando un protocolo basado en EB. Este protocolo fue adaptado de Rössler et al.26 y modificado para aumentar la robustez y permitir la criopreservación durante el proceso de diferenciación. En primer lugar, recolectamos células hematopoyéticas solo una vez después de 10 días de diferenciación. A continuación, las células hematopoyéticas se criopreservaron para permitir una mayor flexibilidad durante el proceso de diferenciación. Además, aumentamos la densidad de siembra de células hematopoyéticas de 1 x 105 a 2 x 105 células/cm2 para la diferenciación de OC. Se utilizó un medio humano más reciente libre de suero iPSC (hiPSC-SFM, ver Tabla de Materiales), y el recubrimiento de los pocillos se realizó con 200-300 μg/mL de un extracto de membrana basal (ver Tabla de Materiales) en lugar de gelatina al 0,1%. La penicilina/estreptomicina no se añadió a los medios de comunicación.
El protocolo de Rössler et al.26 fue adaptado originalmente de una iPSC a un protocolo de diferenciación de macrófagos28 que utiliza la formación de EB para la diferenciación hematopoyética. Si bien la formación de EB ha sido utilizada durante un tiempo prolongado por los investigadores para la diferenciación hematopoyética29,30, se han descrito varios métodos de inducción de EB en la literatura, como la agregación espontánea, la centrifugación en una placa de pocillo de fondo redondo, el cultivo en gotas colgantes, el cultivo en biorreactor, el cultivo en tubo cónico, el vaso lateral de giro lento y el cultivo en gel de micromoho31. Este protocolo utiliza la centrifugación de iPSC disociadas en una placa de pocillos de fondo redondo para acercar las células iPSC individuales entre sí y permitir la formación de esferas (EB), como se describe a continuación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ofrece un método fiable y robusto para diferenciar las iPSC en OC. Sin embargo, hay varios escollos que se pueden encontrar a lo largo del proceso de diferenciación. Las líneas de iPSC humanas generadas a partir de células de diferentes orígenes tisulares se han diferenciado con éxito utilizando este protocolo33. Al volver a congelar las iPSC (consulte el paso de protocolo “3. Congelación de iPSCs”), un pozo en el punto de paso se congeló de nuevo en un criovial. Al desconge…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Giachelli por su ayuda técnica y apoyo. Agradecemos al Centro de Microscopía W. M. Keck y al gerente del Centro Keck, el Dr. Nathanial Peters, por su ayuda en la obtención de las imágenes de microscopía confocal y microscopía de campo amplio. También agradecemos a la UW Flow Core Facility y al gerente de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, por su apoyo técnico y asistencia. Por último, agradecemos a Hannah Blümke el apoyo con la ilustración y el diseño gráfico.
La financiación se proporcionó a través de la subvención R35 HL139602-01 de los Institutos Nacionales de Salud. También reconocemos la subvención S10 de los NIH S10 OD016240 para la financiación de instrumentos en el Centro W. M. Keck, así como la subvención 1S10OD024979-01A1 de los NIH para la financiación de instrumentos en el Centro Central de Flujo de la UW.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
Referenzen
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