Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.
Abstract
Verschiedene Techniken zur Isolierung von Knochenmark aus adulten Mäusen sind gut etabliert. Die Isolierung von Knochenmark aus neonatalen Mäusen ist jedoch eine Herausforderung und zeitaufwändig, aber für einige Modelle translational relevant und notwendig. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und unkomplizierte Methode zur Aufbereitung von Knochenmarkzellen von 7-9 Tage alten Welpen. Diese Zellen können dann weiter isoliert oder in bestimmte Zelltypen von Interesse differenziert werden. Makrophagen sind wichtige Immunzellen, die eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Infektionen spielen. Während der Entwicklung tragen neonatale Makrophagen wesentlich zum Gewebeumbau bei. Darüber hinaus unterscheiden sich der Phänotyp und die Funktionen neonataler Makrophagen von denen ihrer erwachsenen Gegenstücke. Dieses Protokoll beschreibt auch die Differenzierung von neonatalen Makrophagen von den isolierten Knochenmarkzellen in Gegenwart von L929-konditioniertem Medium. Oberflächenmarker für differenzierte neonatale Makrophagen wurden mittels durchflusszytometrischer Analyse untersucht. Um die Funktionalität zu demonstrieren, wurde die phagozytäre Effizienz auch mit pH-sensitiven Farbstoff-konjugierten Escherichia coli getestet.
Introduction
Das Knochenmark umschließt sowohl hämatopoetische als auch mesenchymale Stammzellpopulationen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelllinien differenziert werden können. Hämatopoetische Stammzellen im Knochenmark führen zu myeloischen und lymphoiden Linien1. Mesenchymale Stammzellen produzieren Osteoblasten (Knochen), Adipozyten (Fett) oder Chondrozyten (Knorpel)2. Diese Zellen haben vielfältige Anwendungen im Bereich der Zellbiologie und des Tissue Engineering, einschließlich der Gentherapie 3,4. Im Knochenmark vorkommende Vorläuferzellen differenzieren sich in Gegenwart von linienspezifischen Wachstumsfaktoren in spezifische Zelltypen. Erythropoietin fördert die Proliferation von erythroiden Vorläuferzellen, der Granulozyten-Kolonie-stimulierende Faktor (G-CSF) stimuliert das Wachstum neutrophiler Kolonien und Thrombopoietin reguliert die Produktion von Blutplättchen, um nur einige Beispiele für linienspezifische Wachstumsfaktorenzu nennen 5. Das mit Zelloberflächenantigen markierte FACS und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) sind etablierte Methoden zur Isolierung und Reinigung der spezifischen Zelltypen aus dem Knochenmark6.
Obwohl Neugeborenenstudien Fortschritte machen, um die Ursachen für den Tod von Neugeborenen zu finden und die Komplikationen bei Frühgeburten zu behandeln, bleibt die direkte therapeutische Entwicklung ein ungedeckter medizinischer Bedarf. Smith und Davis stellten fest: “Pädiatrische Patienten bleiben therapeutische Waisen”7. Es gibt mehrere Herausforderungen, wie z. B. kleine Stichproben, lebenslange Auswirkungen des Ergebnisses und ethische Fragen bei der Einholung der Einwilligung in klinischen Studien mit Neugeborenen8. Daher besteht ein hoher Bedarf an in vivo und in vitro Studienmodellen, die spezifisch für Neugeborene sind, um translationale Relevanz zu erreichen. Aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen anatomischen und Gewebeebenen, kurzen Schwangerschaftszeiten und Wurfgrößen sind Nagetiere das am besten untersuchte Säugetiermodellsystem.
Hier beschreiben wir ein detailliertes, sehr praktikables und reproduzierbares Verfahren zur Isolierung von Knochenmark von 7-9 Tage alten Mausbabys und deren Fähigkeit, sich in Makrophagen zu differenzieren. Eine Vielzahl von Zelllinien konnte jedoch durch die Verwendung unterschiedlicher Differenzierungssignale erreicht werden. Wir zeigen auch das Vorhandensein von Zelloberflächenmarkern und das Vorhandensein von in vitro phagozytärer Aktivität, die für aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (BMDMs) erwartet wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Forschung an neugeborenen Mausmodellen kann eine Reihe von Herausforderungen mit sich bringen. Neugeborene haben ein sich entwickelndes Immunsystem, das im Vergleich zu Erwachsenen einzigartig ist8. Daher sollte nicht davon ausgegangen werden, dass Daten, die aus adulten Tiermodellen generiert wurden, auf Neugeborene zutreffen, und mehrere veröffentlichte Arbeiten haben diese Idee gut artikuliert18,19. Daher sind neonatalspezifische M…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01 AI163333] an CMR unterstützt. Wir danken für die zusätzliche finanzielle Unterstützung der West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility durch die folgenden Zuschüsse: WV CTSI Grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE Grant GM121322 und NIH Grant OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
Referenzen
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