光生体調節増強を用いたハイドロゲル中での脂肪由来幹細胞の三次元細胞培養

Summary

ここでは、脂肪由来幹細胞(ADSC)培養のための3次元(3D)細胞培養フレームワークとしてのハイドロゲルの使用と、3D培養環境内でのADSCの増殖を促進するための光生体調節(PBM)の導入を実証するプロトコルを紹介します。

Abstract

脂肪由来幹細胞(ADSC)は、幹細胞に似た多能性間葉系の特徴を持ち、多様な細胞分化能を持ち、遊走・増殖の促進・炎症緩和などの能力を有することから、再生医療に利用されています。しかし、ADSCは、主に好ましくない炎症状態のために、創傷内での生存と生着に課題に直面することがよくあります。この問題に対処するために、創傷におけるADSCの生存率を維持し、創傷治癒プロセスを促進するハイドロゲルが開発されました。ここでは、3D細胞培養フレームワーク内でのADSC増殖と細胞毒性に対する光生体調節(PBM)の相乗効果を評価することを目的としていました。不死化ADSCを10μLのハイドロゲルに2.5×10³ 細胞の密度で播種し、525nmおよび825nmのダイオードを用いて5J/^cm2 および10J/^cm2の流暢さで照射した。形態学的変化、細胞毒性、および増殖は、PBM曝露後24時間および10日後に評価されました。ADSCは丸みを帯びた形態を示し、個々の細胞またはスフェロイド凝集体としてゲル全体に分散していました。重要なことは、PBMと3D培養フレームワークの両方が細胞に細胞傷害性の影響を示さなかったのに対し、PBMはADSCの増殖速度を有意に高めたことです。結論として、この研究は、ADSC培養に適した3D環境としてのハイドロゲルの使用を実証し、特に3D細胞培養に関連する増殖速度の遅さに対処する重要な増強戦略としてPBMを導入します。

Introduction

ADSCは、自己複製して複数の細胞系統に分化する能力を持つ間葉系多能性前駆細胞です。これらの細胞は、脂肪吸^引法中に脂肪組織の間質血管分画(SVF)から採取することができる1。ADSCは、豊富で、採取に対する侵襲性が低く、入手が容易で、特性が良好であるため、再生医療に使用するのに理想的な幹細胞タイプとして浮上しています²。幹細胞治療は、細胞の遊走、増殖、血管新生を刺激し、創傷内の炎症を軽減することにより、創傷治癒の道筋を提供します^3,4。ADSCの再生能力の約80%は、セクレトーム⁵を介したパラクリンシグナル伝達に起因しています。以前は、損傷した組織に幹細胞または成長因子を直接局所的に注入すると、in vivo修復メカニズムが十分に低下する可能性があることが示唆されていました^6,7,8。しかし、このアプローチは、生存率の低下や、^{炎症環境の結果として}損傷した組織内の幹細胞生着の減少など、いくつかの課題に直面していました9。さらに、理由の1つは、移植された細胞の生存と機能をサポートするための細胞外マトリックスの欠如であった¹⁰。これらの課題を克服するために、現在、幹細胞の生存率と機能をサポートする生体材料担体の開発に重点が置かれています。

3次元(3D)細胞培養は、in vitroでの細胞間および細胞とマトリックス間の相互作用を強化して、in vivo環境によりよく類似した環境を提供する¹¹。ハイドロゲルは、幹細胞培養のための3D環境を提供する生体材料担体のクラスとして広く研究されてきました。これらの構造は、水と架橋^{ポリマー12}からなる。ADSCをハイドロゲルに封入しても^、細胞の生存率を維持しながら、培養中の細胞に細胞毒性の影響はほとんどありません6。3Dで培養された幹細胞は、幹細胞性の保持力を高め、分化能を向上させることを示している¹³。同様に、ハイドロゲルを播種したADSCは、動物モデルにおいて生存率の向上と創傷閉鎖の促進を示した¹⁴。さらに、ヒドロゲルのカプセル化は、創傷におけるADSCの生着および保持を有意に増加させる^15,16。TrueGel3Dは、ポリビニルアルコールまたはデキストランのいずれかのポリマーを、架橋剤(シクロデキストリンまたはポリエチレングリコール)で固化させたものです¹⁷。ゲルは、細胞外マトリックスを効果的に模倣しながら、実験を妨害したり、ゲルの患者への移植中に免疫反応を引き起こしたりする可能性のある動物性製品を一切含まない合成ハイドロゲルである¹⁸。ゲルは、組成と個々の成分を変更することにより、完全にカスタマイズ可能です。異なる幹細胞を収容し、ゲル¹⁹の硬さを調整することにより、いくつかの細胞タイプの分化をサポートすることができる。結合部位は、ペプチド²⁰の添加によって作成することができる。ゲルはメタロプロテアーゼの分泌によって分解され、細胞遊走を可能にする²¹。最後に、それは明確であり、イメージング技術を可能にします。

PBMは、細胞内の発色団を刺激するために使用される低侵襲で簡単に実行できる低レベルレーザー療法です。波長が異なれば、細胞に異なる効果がもたらされる²²。赤色から近赤外の範囲の光は、電子伝達系を通るフラックスを増強することにより、アデノシン三リン酸(ATP)および活性酸素種(ROS)産生の増加を刺激する²³。青と緑の範囲の光は、光依存性イオンチャネルを刺激し、カルシウムやマグネシウムなどの陽イオンの細胞内への非特異的流入を可能にし、分化を促進することが知られている²⁴。正味の効果は、遊走、増殖、分化などの下流の細胞プロセスを引き起こす因子の転写を刺激する二次メッセンジャーの生成である²⁵。PBMは、細胞を有害な環境、例えば損傷した組織に移植する前に、細胞が増殖または分化するように前もって調整するために用いることができる²⁶。ADSCの移植前および移植後のPBM(630 nmおよび810 nm)曝露は、糖尿病ラットモデルにおいて、in vivoでのこれらの細胞の生存率および機能を有意に向上させた²⁷。再生医療では、組織を効果的に修復するために十分な数の細胞が必要です²⁸。3D細胞培養では、ADSCは2次元^{細胞培養と比較して}増殖速度が遅いことがわかっている6。しかし、PBMは、生存率、増殖、遊走、および分化を促進することにより、ADSCの3D細胞培養プロセスを強化するために使用できます^29,30。

Protocol

注:このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、およびソフトウェアに関する詳細については、 材料表 を参照してください。プロトコルを 図1にまとめました。 1. 2次元(2D)細胞培養 注:不死化ADSC(1 x106 細胞)は、1 mLの細胞凍結培地を含む凍結保存バイアル内の液体窒素中で-195.8°Cで保存され?…

Representative Results

ハイドロゲルの形態を評価し、細胞密度を目視検査するために、逆顕微鏡を使用しました(図2)。ADSCは、播種およびPBM曝露後24時間で丸みを帯びた形態を保持しました。細胞は、単一細胞として、またはブドウのようなクラスターとしてゲル全体に散在していました。形態は3D培養で10日後も変化しなかった。実験群と対照群の間、または異なる実験群間で形態に決定的な…

Discussion

ADSCは、創傷治癒を助けるさまざまなプロセスを刺激するため、再生医療に使用するのに理想的な細胞タイプです^3,4。しかし、生存率の低さや^損傷部位での細胞の生着効果のなさなど、回避しなければならないいくつかの課題があります9。不死化細胞は、初代細胞と比較してより多くの世代にわたって継代することができ、収穫す…

Materials

525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher – Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader