הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

Summary

ככל שתחום הריפוי הגנטי ממשיך להתפתח, יש צורך הולך וגובר בשיטות חדשניות שיכולות להתמודד עם אתגרים אלה. כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמה של מפעל תאים, העומדים בתקני האיכות למחקרי in vivo .

Abstract

מחקר פרה-קליני בריפוי גנטי, במיוחד במודלים של מכרסמים ובעלי חיים גדולים, מחייב ייצור של וקטורי AAV בעלי תפוקה וטוהר גבוהים. גישות מסורתיות במעבדות מחקר כוללות לעתים קרובות שימוש נרחב בצלחות תרבית תאים לגידול תאים HEK293T, תהליך שיכול להיות מייגע ובעייתי כאחד. כאן מוצגת שיטה פנימית ייחודית, המפשטת תהליך זה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ספציפית (או מחסניות תאים, CF10). שילוב של פוליאתילן גליקול/חלוקה דו-פאזית מימית עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול משפר הן את התפוקה והן את הטוהר של וקטורי AAV שנוצרו. טוהר וקטורי ה-AAV מאומת באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף, בעוד שהיחס בין חלקיקים מלאים לריקים נקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM). גישה זו מציעה פלטפורמה יעילה לייצור וקטורי AAV בתפוקות גבוהות, יחד עם שיטת טיהור משופרת כדי לענות על דרישות האיכות למחקרי in vivo .

Introduction

וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הפכו לכלי חיוני במחקר ריפוי גנטי, ומציעים שילוב ייחודי של יעילות ובטיחות להעברת גנים¹. שיטות מסורתיות ליצירת AAVs בסביבות מעבדה היו מרכזיות בקידום ההבנה והיישום שלנו של ריפוי גנטי². עם זאת, שיטות אלה, למרות שהן בסיסיות, מציגות מגבלות ואתגרים מסוימים, במיוחד במונחים של תפוקה, יעילות זמן ואיכות הווקטורים המיוצרים, בעיקר היחס בין חלקיקים מלאים לריקים³.

ההליך הקונבנציונלי לייצור AAV כולל בעיקר טרנספקציה של תאי HEK293⁴. תהליך זה, המתבצע בדרך כלל בצלחות תרבית תאים, דורש מהתאים להיות נגועים בפלסמיד המכיל את הגן המעניין יחד עם פלסמיד עוזר ופלסמיד קפסיד AAV ^5,6. לאחר ההדבקה, התאים מייצרים חלקיקי AAV, אשר לאחר מכן נקצרים ומטוהרים ^5,6. תהליך הטיהור כולל לעתים קרובות אולטרה-צנטריפוגה, שלב קריטי בהשגת וקטורי AAV בעלי טוהר גבוה⁷. אולטרה-צנטריפוגה, במיוחד באמצעות צזיום כלוריד (CsCl) או שיפוע יודיקסנול, היא שיטה סטנדרטית להפרדת חלקיקי AAV מפסולת תאית וזיהומים אחרים⁸. שלב זה חיוני להשגת הטוהר והריכוז הרצויים של וקטורי AAV, אשר משפיע ישירות על יעילותם בהעברת גנים⁸. למרות השימוש הנרחב שלה, אולטרה צנטריפוגה מסורתית יש חסרונות שלה. לדוגמה, התפוקה של וקטורי AAV משיטה זו יכולה להיות משתנה ולעתים קרובות נמוכה, מה שמציב אתגרים משמעותיים כאשר יש צורך בכמויות גדולות של וקטורים בעלי טיטר גבוה, במיוחד עבור מחקרי in vivo או מודלים של בעלי חיים גדולים⁹.

היבט קריטי נוסף של איכות וקטור AAV הוא היחס בין חלקיקים מלאים לריקים¹⁰. תכשירי AAV מכילים לעתים קרובות תערובת של חלקיקים אלה; עם זאת, רק החלקיקים המלאים מכילים את החומר הגנטי הטיפולי. נוכחות של שיעור גבוה של חלקיקים ריקים יכולה להפחית באופן משמעותי את היעילות של העברת גנים¹⁰. הערכה ואופטימיזציה של היחס בין חלקיקים מלאים לריקים היא אפוא פרמטר מפתח בהערכת היעילות של וקטורי AAV. שיטות מסורתיות, בעוד שהן מסוגלות לייצר וקטורי AAV, מתקשות לעתים קרובות לשלוט ביחס זה באופן עקבי, מה שמוביל לשינויים בעוצמה הווקטורית¹⁰.

כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים ללא שימוש בתרביות תאי HEK293T עתירות עבודה בצלחות תאים, תוך שילוב פוליאתילן גליקול/חלוקה דו-פאזית מימית עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול. טוהר וקטור AAV מאושר באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף, ויחס החלקיקים המלא לריק נקבע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), העומד בתקני האיכות של מחקרי in vivo ¹¹.

Protocol

פרטי הריאגנטים, הפלסמידים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים. הרכב המאגרים בהם נעשה שימוש מופיע בקובץ משלים 1. 1. הכנת פלסמיד התמירו פלסמידים (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) ב-E. coli.הערה: ניתן להשתמש בכל זן E.coli להגברת פלסמיד. עבור פלסמידים מסוימים, תאים מוכשרים מיוחדים כגון יציב NEB יכולים לשפר את תשואת הפלסמיד. שלושת הפלסמידים המשמשים בפרוטוקול זה הם pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 ו-pAAV-Cap: pAAV-RC6. לגדל חיידקים במדיה LB המכילה את האנטיביוטיקות הסלקטיביות המתאימות בנפח אופטימלי של 37 ° C למשך 16-18 שעות.הערה: בעת שימוש בתאים יציבים NEB, תרבית ב 30 ° C במשך 18-20 שעות. קצרו DNA פלסמיד על ידי צנטריפוגה של E. coli. תרבית בינונית ב 4000 x גרם, 4 ° C, במשך 15 דקות. שפכו בזהירות את נוזל העל מבקבוק הצנטריפוגה למיכל פסולת וטיהרו את הדנ”א של הפלסמיד מהגלולה בעזרת ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה גדול ללא אנדוטוקסין.הערה: הקפידו לשפוך אותו לאט ולהימנע מהתזה. למדוד את ריכוז הדנ”א ואת טוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.הערה: בדוק את טוהר ה- DNA על-ידי בדיקת יחס OD260/OD280 . היחס לדנ”א טהור הוא כ-1.8. ריכוז ה- DNA צריך להיות מעל 1 מיקרוגרם / μL עבור שלב מאוחר יותר co-transfection. צור מלאי גליצרול חיידקי על ידי הוספת 500 μL של תרבית לילה ל 500 μL של 50% גליצרול ב cryovial ולאחסן ב -80 ° C. 2. הכנת תאי HEK293T זרעו HEK293T תאים עם מדיה גבוהה של גלוקוז DMEM המכילה 10% FBS למפעל תאים בן 10 שכבות (CF10) ותנו לתאים לגדול באינקובטור בן לילה.הערה: המעברים של תאי 293T צריכים להיות פחות מ-10 כדי לקבל את המצב האופטימלי לייצור AAV חזק. במידת האפשר, אל תוסיפו אנטיביוטיקה לאמצעי התרבות בשלב זה. שטח הפנים של CF10 גדול בערך פי 42 מזה של צלחת תרבית תאים בקוטר 150 מ”מ. זרעו את אותה צפיפות תאים בצלחת תרבית תאים בקוטר 150 מ”מ כדי לאפשר בדיקת גדילת התאים תחת מיקרוסקופ. הכינו תרחיף תאים של 1075 מ”ל, הוסיפו תרחיף תאים של 25 מ”ל לצלחת של 150 מ”מ והוסיפו את הנותרים ל-CF10. בדוק את מפגש התאים למחרת לפני הטרנספקציה.הערה: תאים צריכים להגיע למפגש של 80%-90% בזמן הטרנספקציה על ידי התבוננות תחת מיקרוסקופ. 3. טרנספקציה משולשת של פלסמידים AAV חשב את כמות כל פלסמיד הדרוש (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-סרוטיפ) כדי לקבל יחס מולארי של 1.2: 1: 1 עם 2.5-5 מ”ג של DNA כולל לכל CF10.הערה: היחס המולרי של שלושת הפלסמידים עשוי להיות משתנה לקבלת יעילות הטרנספקציה האופטימלית. עדיף לבדוק אותו בקנה מידה קטן לפני המעבר להגדרה זו של CF10. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 ו- pAAV-RC6 משמשים לייצור וירוס AAV6-CMV-GFP כדוגמה. נוסחת מחשבון PEI מופיעה בטבלה 1. Aliquot 350 מ”ל של OptiMEM לתוך בקבוק סטרילי 500 מ”ל. הוסף את כל שלושת הדנ”א של פלסמיד לבקבוק המכיל את Opti-MEM. מערבבים היטב. הוסף 15 מ”ל של תמיסת פוליאתילנימין (PEI) 1 מ”ג/מ”ל (יחס DNA למיקרוגרם PEI) 1:3 מיקרוגרם). נערו את תערובת OptiMEM/DNA/PEI מעלה ומטה במרץ במשך 30 שניות.הערה: זה בסדר לעשות בועות. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.הערה: דגירה ארוכה יותר עלולה להפחית את יעילות הטרנספקציה. הוסף את תמיסת OptiMEM/DNA/PEI לבקבוק 1 ליטר המכיל 700 מ”ל של גלוקוז נמוך DMEM עם 10 mM HEPES ו-2% FBS. מערבבים היטב.הערה: במחקר זה, גלוקוז נמוך ב- DMEM הראה ייצור וקטורי AAV טוב יותר לאחר טרנספקציה משותפת. תוספת של HEPES מסייעת לשמור על התאים במצב טוב יותר. מערבבים על ידי סיבוב הבקבוק באיטיות. הימנעו מיצירת יותר מדי בועות. הוציאו את CF10 מהאינקובטור ושאבו את המדיה החוצה לתוך מיכל פסולת.הערה: הניחו את CF10 על המשטח בתוך מכסה המנוע והרימו בהדרגה צד אחד למעלה, שאבו באיטיות את המדיה החוצה מבלי לנתק את התאים. הוסיפו בזהירות את תערובת המשקפים ל-CF10. ודא שכל עשר השכבות מכוסות במדיה.הערה: יש להוסיף 25 מ”ל של תערובת מדבקת לצלחת בקוטר 150 מ”מ. עקוב אחר התאים מדי יום עד הקציר. הוסיפו את שארית תערובת הזיהומים ל-CF10 על ידי מזיגה איטית. סובבו את CF10 בזהירות רבה והבטיחו נפח שווה לכל שכבה. להחזיר את CF10 לאינקובטור למשך 72-96 שעות.הערה: בדוק את צלחת הצג בקוטר 150 מ”מ כדי להחליט מתי לקצור את וקטורי ה-AAV. כאשר התאים מתנתקים בקלות רבה עם עומס מלא של AAV, הגיע הזמן לקצור. 4. קצירת וקטורי AAV קצרו את הנגיף 3-4 ימים לאחר ההדבקה על ידי ניעור נמרץ של CF10. יוצקים את התקשורת לתוך צינורות חרוטי 250 מ”ל ולסובב את הנגיף ב 4000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.הערה: עבור סרוטיפ AAV6 המשמש בפרוטוקול זה, 80% AAV יישאר קשור ברובו לחומר תאי בכדורית. ו-20% AAV הופרשו לתקשורת. פרופורציות אלה עשויות להיות שונות עבור סרוטיפים אחרים AAV. סנן סופרנאטנט מובהר עם יחידת סינון של 0.45 מיקרומטר ושמור אותו למשקעים. שטוף את CF10 עם 500 מ”ל של DPBS, חיץ אחד וצנטריפוגה במהירות 4000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות מערכת ואקום ופיפטה שואפת. הוסף 20 מ”ל של חיץ ליזיס AAV לכל CF10 ב -80 ° C עד לטיהור.הערה: העבר ליזט AAV לצינור חרוטי של 50 מ”ל למיצוי AAV מאוחר יותר. הוציאו את הסופרנאטנט המסונן, הוסיפו 40% תמיסת PEG-2.5M NaCl לריכוז סופי של 8% PEG, ודגרו בחדר קר על מסובב אורביטלי למשך 3 שעות או לילה לפחות.הערה: עבור 100 מ”ל supernatant, להוסיף 25 מ”ל 40% PEG-2.5 M NaCl פתרון. לזרז את הנגיף על ידי צנטריפוגה ב 4000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.הערה: מעבירים את התערובת לצינורות חרוטיים בנפח 250 מ”ל לצנטריפוגה. שואפים להסיר supernatant ולהוסיף 5-10 מ”ל של חיץ מתלה AAV HEPES כדי להשהות את הכדורים. מעבירים לתוך צינור חרוטי 50 מ”ל כדי להמשיך את הטיהור במורד הזרם, או לאחסן אותו ב -80 ° C. 5. מיצוי AAV הפשיר את גלולת הנגיף באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות עם שייקר.הערה: מערבלים את הליזט AAV כדי להמיס לחלוטין. מקפיאים באמבט 100% אתנול בטמפרטורה של -80°C למשך 20-30 דקות.הערה: לחלופין, מחזור ההקפאה יכול להיעשות עם אתנול 100% קרה מוקפת קרח יבש. יש להקפיא/להפשיר 3-4 פעמים, ולערבל בין לבין במידת הצורך.הערה: ניתן להשהות מחזור זה בשלב ההקפאה. אחסן את הליזט AAV ב -80 ° C עד לעבודה במורד הזרם. הפשירו ליזה AAV (משלב 5.3) והשעו מחדש AAV (משלב 4.7)” באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות עם שייקר, ומערבולת.הערה: הקפידו להמיס לחלוטין ולערבב. הוסף נוקלאז בנזונאז (250 יחידות/μL) ל-AAV ליזט ו-AAV מושעה מחדש לקבלת ריכוז סופי של 50 יחידות/מ”ל. מערבולת את הפתרון. יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רעידות למשך 30 דקות.הערה: הוציאו 10% נתרן deoxycholate aliquots באמבט מים כדי לאפשר זמן להתמוסס, להתחמם ולערבב היטב. הוסיפו 10% נתרן דאוקסיכולאט לקבלת ריכוז סופי של 0.5% ודגרו בטמפרטורה של 37°C עם שייקר למשך 30 דקות.הערה: נתרן deoxycholate שימש כדי לשפר את שחרור AAV מהתאים. הפץ את תמיסת ה- AAV הגולמית בצינורות צנטריפוגה של 2 מ”ל ובצנטריפוגות ב- 14,000 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי בנפח 50 מ”ל.הערה: השתמש פיפטה 1 מ”ל כדי להעביר את supernatant. השליכו את הכדורים. מוסיפים כמות שווה של כלורופורם וממצים AAV על ידי ערבול במשך 1-2 דקות.הערה: התמיסה צריכה להיות אטומה, לבנה, דמוית חלב. מעבירים את התמיסה החלבית לצינורות צנטריפוגות בנפח 2 מ”ל ומפזרים באופן שווה. צנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בזהירות פיפטה החוצה את השכבה הוורודה העליונה ולהעביר אותו צינור חרוטי חדש 50 מ”ל.הערה: אין להפריע לשכבות הכלורופורם/החלבון. מדדו את עוצמת הקול הסופית באמצעות פיפטה. על פי תרשים הנפח הגולמי AAV-PEG-סולפט (טבלה 2), ערבבו נפחים מתאימים של 50% (NH4)2SO4 ו-40% תמיסת PEG. מערבולת במשך 2 דקות. מעבירים את התערובת לצינורות צנטריפוגות של 2 מ”ל לפיזור שווה. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C לאסוף את השכבה התחתונה באמצעות מחט 22 G מזרק 3 מ”ל. לאסוף את AAV בצינור חרוטי 50 מ”ל ולאחסן אותו ב 4 ° C עבור יודיקסנול הדרגתי מאוחר יותר ultracentrifugation. 6. טיהור AAV על ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול הכינו את שיפועי היודיקסנול טריים לפני טעינת ה-AAV בהתאם למספר צינורות האולטרה-צנטריפוגה שבהם נעשה שימוש (טבלה 3).הערה: פנול אדום שימש כדי לצפות בשכבות. שכבו כל תמיסה לתוך צינור פוליפרופילן אולטרה-צנטריפוגה עגול ואטימה מהירה באיטיות באמצעות מזרק 10 מ”ל המחובר עם מחט ארוכה מנוקבת 16 גרם. הימנעו מבועות. הוסף בזהירות עד 17 מ”ל של תמיסת AAV על גבי שיפוע עם מזרק 22 G. השתמש במאגר דיאליזה AAV כדי לקלף את הצינור.הערה: הוסף את תמיסת ה- AAV על-ידי טעינת טיפות על הקיר בצינור האולטרה-צנטריפוגה. אין להפריע לשכבות מעבר הצבע. אטמו את צינורות האולטרה-צנטריפוגות באמצעות אוטם חשמלי.הערה: אזנו את הצינורות לפני שליחתם לאולטרצנטריפוגה בהפרש של 0.2 גרם ±. צנטריפוגה ב 350,000 x גרם במשך 2 שעות ברוטור Ti70 ב 4 ° C. בזהירות להסיר את צינורות מן הרוטור ומניחים אותם במתלה צינורות ultracentrifuge.הערה: ודא שהמעברים ההדרגתיים אינם מופרעים. אסוף שברי AAV לפי השלבים הבאים:ייצבו את הצינור על מחזיק מעמד. נקב את צינורות אולטרה צנטריפוגה מעט מתחת לממשק 40%-60% עם מחט 19 G המחוברת מזרק 10 מ”ל.הערה: פתח המחט צריך להיות כלפי מעלה, מול שיפוע של 40%. ניקוב חור בחלק העליון של הצינור עם מחט 16 גרם. לאסוף עד 5 מ”ל לכל צינור. הימנעו מאיסוף זיהום החלבון בממשק של 25%-40%. חזור על הפעולה עבור כל צינור אולטרה-צנטריפוגה.הערה: העבר את שברי AAV לצינור חרוטי של 50 מ”ל. 7. סיבוב שני יודיקסנול הדרגתי אולטרה-צנטריפוגה הערה: שלב זה הוא אופציונלי. שלב זה הוא להפחית את יחס AAV הריק לקבלת קפסיד AAV מלא באיכות גבוהה יותר. דילול AAV >1:1 עם חיץ דיאליזה AAV.הערה: AAV שנאסף מהסבב הראשון של אולטרה-צנטריפוגה היה בשכבת יודיקסנול של 40%. זה צריך להיות מדולל על ידי לפחות 50% כדי להיות מסוגל להיות טעון על גבי שכבת 30% יודיקסנול. הניחו כל תמיסה (טבלה 4) לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה באמצעות מחט מנוקבת של 16 G וחברו באיטיות מזרק בנפח 10 מ”ל. הימנעו מבועות. בזהירות להוסיף 20 מ”ל של פתרון AAV מדולל על גבי שיפוע עם מזרק 22 גרם. השתמש במאגר דיאליזה AAV כדי לקלף את הצינור. חזור על השלבים 6.4 עד 6.7. 8. דיאליזה AAV וריכוז להעביר את וירוס AAV לתוך קלטת דיאליזה באמצעות מחט חדשה 18 G מזרק 10 מ”ל. לאט לאט להזריק את הנגיף לתוך קלטת ולהוציא אוויר ממנו. הוסיפו לכוס ערבוב המכילה חיץ דיאליזה AAV והניחו על צלחת ערבוב. הכניסו את קלטת הדיאליזה למאגר הדיאליזה בעזרת מצוף ציפה. יש לערבב ב-4°C. שנה פי 2-3 את מאגר הדיאליזה AAV.הערה: השתמש במאגר מספיק כדי לאפשר לקלטת לצוף ולבצע את החלפת המאגר. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום. באמצעות מזרק 10 מ”ל מחובר עם מחט 18 גרם, לאסוף את הנגיף מן הקלטת לתוך יחידת מסנן צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם במשך 15-30 דקות ב 4 ° C.הערה: יש לשטוף את ה-AAV עם חיץ דיאליזה AAV 2-3 פעמים. רכז את ה- AAV עד ~ 200 μL של הנותר על גבי המסנן. אסוף את ה- AAV המרוכז מיחידת הסינון. שטפו את המסנן עם עוד 300 μL של מאגר דיאליזה AAV והעבירו אותו ל-AAV המרוכז. סנן את הנגיף דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 1 מ”ל שחפת להחליק. כדי להבטיח אובדן נפח מינימלי, השתמש במזרק 10 מ”ל כדי לדחוף אוויר דרך המסנן 2-3 פעמים. אחסן את נגיף AAV מטוהר ב 4 ° C באופן זמני לטיטרציה.הערה: טיטרט את הנגיף, aliquot, ולאחסן ב -80 ° C בתוך שבוע אחד. 9. טיטרציה של נגיף AAV הערה: תגובת שרשרת פולימראז כמותית TaqMan (qPCR) שימשה לטיטרציה של AAV מטוהר. יש לטפל בווקטורים AAV עם DNase I ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.הערה: כדוגמה לתגובה של 10 μL, נעשה שימוש בדגימת וירוס AAV של 2 μL, 1 μL DNase, מאגר DNase של 1 μL ו- 6 μL H2O. זה יכול להתבצע thermocycler עם צינורות PCR. הכינו את ערכות הפריימר המתמקדות באזור הוספת AAV.הערה: המטרות יכולות להיות המקדם, הטרנסגן והכתב במבנה AAV. הפריימרים מפורטים בטבלה 5. הכינו תקני פלסמיד DNA (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ו- 0.0001 pg/μL) ובקרה שלילית (H2O). הכינו את תערובת האב qPCR, כולל פריימרים, בהתאם להוראות היצרן. הניחו את התקנים והדגימות בשילוש על לוחית PCR. הוסף את תערובת qPCR לתקנים ולדגימות. אטמו את הצלחת ובצעו את תגובת ה-qPCR בהתאם להוראות היצרן.הערה: תנאי התגובה תלויים בחומרים/ריאגנטים ובמכשיר. מחזורי PCR מהירים וקונבנציונליים ישימים. חישוב טיטר וירוס AAV.הערה: ריכוז הדגימה בפרוטוקול זה הוא דילול של 1/10 מהדגימות המקוריות. Aliquot וירוס AAV בצינורות 1.5 מ”ל ולאחסן ב 4 ° C עד חודש אחד לאחסן ב -80 ° C לטווח הארוך.הערה: הימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה עבור האחסון. כאשר משתמשים בניסויי in vivo , אין להשתמש בהפשרה מעל פעמיים aliquots. 10. בקרת איכות של AAV הערה: נגיפי AAV אופיינו לטוהר על ידי כתם כסף SDS-PAGE באמצעות ג’ל SDS-PAGE והוכתמו באמצעות ערכת צביעה מסחרית. Denature 3 x 109 vg של דגימת וירוס AAV עם מאגר Laemmli.הערה: השתמש בווירוס AAV הפניה כפקד. נעשה שימוש בקפסיד מלא לייחוס AAV6-CMV-GFP. טען את ה-AAV המפורק על ג’ל SDS-PAGE הדרגתי של 4%-20% והפעל במתח של 180 וולט למשך 50 דקות. מוציאים את הג’ל מצלחת האלקטרופורזה. מכתימים את הג’ל בערכת צביעה כסופה בהתאם להוראות היצרן. בדוק את חלבוני הקפסיד AAV VP1, VP2 ו- VP3.הערה: וירוס AAV טהור מכיל רק VP1, VP2 וחלבון קפסיד VP3. אם לא טהור, רצועות חלבון אחרות ייראו על הג’ל.הערה: מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של נגיפים רקומביננטיים רקומביננטיים מוכתמים שליליים בוצע כדי להעריך שלמות מורפולוגית ויחס מלא/ריק. הרימו רשת EM עם פינצטה והניחו על הספסל כשהצד המבריק של הרשת פונה כלפי מעלה. פיפט 5 μL של דגימת AAV על הרשת ולאפשר לה להתייבש על ידי אידוי.הערה: יש לדלל את ה-AAV במידת הצורך. 1012 vg / mL הוא titer ממוצע. זה עלול לקחת 30-60 דקות כדי לייבש את הרשת. לשטוף את הרשת על ידי pipetting, טיפה אחר טיפה, עם כ 200 μL של H2O על הרשת. הסר את עודפי המים על-ידי הנחת נייר כרומטוגרפיה אנכית ליד הרשת. Pipet 5 μL של 2% תמיסת אצטט Uranyl על הרשת. דוגרים במשך 5 דקות ומנדפים כאמור. הניחו לרשת להתייבש. דמיינו את חלקיקי ה-AAV תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (בהגדלה של פי 50,000). קפסידים נגיפיים בעלי גנום ויראלי יופיעו כמשושים לבנים הומוגניים, בעוד שקפסידים ריקים יופיעו כמשושים בעלי שפה לבנה אך מרכז כהה. ספור באופן אקראי לפחות 100 חלקיקים כדי לקבוע את האחוז המשוער של מלא לעומת . חלקיקי AAV ריקים.

Representative Results

בפרוטוקול מפורט זה, שלב אחר שלב, מודגמת פלטפורמה סטנדרטית לייצור וירוס AAV איכותי ואיכותי עם CF10 במסגרת מעבדת מחקר בקנה מידה גדול. בהשוואה לצלחות קונבנציונליות של תרביות תאים, CF10 מספק דרך נוחה לתרבית כמויות גדולות של תאים ולייצר וירוס AAV (איור 1). מספר תנאי תרבית נבדקו כדי לקבוע אם תאים בסביבה אופטימלית יכולים לקדם ייצור ויראלי. DMEM דל גלוקוז בתוספת HEPES של 10 mM ו- 2% FBS הראה את ייצור ה- AAV הטוב ביותר. מספר פרוטוקולים נבדקו כדי לטהר AAVs. לרוב ההליכים יש תפוקת וירוסים נמוכה וטומאה של קפסידים AAV. כאן פותח פרוטוקול טיהור מתוקן, המשלב את ה-AAV הן מכדוריות התאים והן ממדיית התרבית (איור 2). מצאנו ש-80% מה-AAV היה בתאים, ועוד 20% מה-AAV היה בתרבית, שהופרשו מהתאים. שני חלקי AAV טופלו ב- DNase כדי להסיר את ה- DNA החופשי. נתרן דאוקסיכולאט שימש לשחרור נוסף של AAV מהתאים. לאחר מכן הופקו AAV עם מיצוי כלורופורם ואחריו חלוקה דו-פאזית מימית. צעדים אלה אפשרו להסיר את רוב מזהמי החלבון. AAV נשאר מסיס בשלב האמוניום גופרתי. שאר המזהמים הוסרו באמצעות אולטרה-צנטריפוגה לא רציפה של יודיקסנול (איור 3A). השיפוע סייע גם בהסרת הקפסידים הריקים של AAV, במיוחד בסבב השני של אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול. טוהר נגיף ה-AAV נקבע על ידי כתמי כסף. כאשר התקבלו שלושה פסים עיקריים המתאימים לחלבון קפסיד AAV, VP1, VP2 ו-VP3, עם טוהר של יותר מ-90%, וירוס ה-AAV התאים לשימוש in vivo (איור 3B). TEM (איור 3C) ניגש ליחס הקפסיד המלא לקפסיד הריק של AAV (איור 3C). רק קפסיד מלא עם תוספת טרנסגן יאפשר ביטוי של טרנסגן ברקמת היעד. חלק גבוה של הקפסיד הריק יכול גם לגרום לתגובה חיסונית לקפסיד AAV. בדיקות איכות אלה נחוצות עבור כל וירוס AAV המיוצר ומטוהר לפני השימוש. איור 1: המחשה סכמטית של ייצור AAV על-ידי HEK293T תאים בשיטת טרנספקציה משולשת. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: המחשה סכמטית של טיהור AAV. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: טיהור AAV על-ידי אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול ואימות טוהר נגיף AAV. (A) שכבות שיפוע יודיקסנול ומיקום המחט לקציר. (B) ג’ל מייצג להערכת תכולת הקפסיד וטוהרו. M: סמן מולקולרי; R: התייחסות AAV6 קפסיד מלא; S1: קפסיד AAVDJ תוצרת בית עם סיבוב אחד של אולטרה-צנטריפוגה; S2: קפסיד AAVDJ תוצרת בית עם שני סבבים של אולטרה-צנטריפוגה; S3: קפסיד AAV6 תוצרת בית. (C) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים של AAV. וירוס שנאסף לאחר טיהור. קפסידים נגיפיים המכילים גנום ויראלי מופיעים כמשושים לבנים הומוגניים, בעוד שקפסידים ריקים מופיעים כמשושים בעלי שפה לבנה אך מרכז כהה. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. טבלה 1: מחשבון PEI עבור אריזות AAV. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: תרשים נפח גולמי AAV-PEG-סולפט. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 3: הכנת שיפוע יודיקסנול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 4: הכנת שיפוע יודיקסנול סיבוב שני. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 5: פריימרים לטיטרציה AAV. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. קובץ משלים 1: הרכבי המאגרים ששימשו למחקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

כאן, פרוטוקול מתקדם מבחינה טכנית לייצור בקנה מידה גדול של וקטורי AAV באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה באמצעות פלטפורמת מפעל תאים (CF10) מוצג, המייצג שיפור משמעותי לעומת שיטות צלחת תרבית תאים קונבנציונליות. השימוש במפעלי תאים מפשט את תהליך טיפוח כמויות גדולות של תאים, ומקל על ייצור נגיפי AAV בצורה יעילה יותר¹. כמו כן, על ידי אופטימיזציה של תנאי התרבית, במיוחד עם DMEM גלוקוז נמוך בתוספת 10 mM HEPES ו 2% FBS, ייצור ויראלי משופר באופן משמעותי אושר, המציין את התפקיד המכריע של הסביבה התאית בתפוקת הנגיף.

פרוטוקול הטיהור המתוקן, המשלב AAV הן מכדורי תאים והן ממדיות תרבית, מטפל בבעיה הנפוצה של תפוקת וירוסים נמוכה וטומאה הנראית בפרוטוקולים קיימים רבים. השלבים של מיצוי כלורופורם וחלוקה דו-פאזית מימית מסירים ביעילות את רוב מזהמי החלבון, כאשר AAV נשאר מסיס בשלב האמוניום גופרתי. ניתן לייחס את השיפור הן בתפוקה והן בטוהר של וקטורי AAV באמצעות חלוקה דו-פאזית PEG/מימית בשילוב עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול, בניגוד לשיטות אולטרה-צנטריפוגות מסורתיות של שיפוע, להפרדה ראשונית משופרת עם חלוקה דו-פאזית PEG/מימית, טוהר מזוקק עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול והפחתה בטיהור משותף של מזהמים¹². ראשית, הכנסת חלוקה דו-פאזית PEG/מימית לפני אולטרה-צנטריפוגה משפרת באופן משמעותי את ההפרדה הראשונית של חלקיקי AAV מפסולת תאית ומזהמים אחרים. PEG, פולימר בעל משקל מולקולרי גבוה, כאשר הוא מעורבב עם תמיסה מימית, יוצר שני שלבים נפרדים¹³. לווקטורים AAV יש נטייה להתחלק באופן מועדף לאחד השלבים הללו (בדרך כלל השלב העשיר ב-PEG), בעוד שמזהמים וזיהומים רבים מחולקים^ל-13 האחרים. חלוקה סלקטיבית זו מרכזת ביעילות את חלקיקי ה-AAV ומסירה חלק ניכר מהזיהומים עוד לפני האולטרה-צנטריפוגה, ובכך מגדילה את התפוקה ומפחיתה את עומס המזהמים הנכנס לשלב¹³ של האולטרה-צנטריפוגה. שנית, אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של יודיקסנול מעדנת עוד יותר את הטוהר של וקטורי AAV. יודיקסנול, תווך שיפוע איזו-אוסמולרי לא יוני, מאפשר הפרדה עדינה ומבוקרת יותר בהשוואה לשיפועי CsCl מסורתיים¹⁴. בשיפוע זה, חלקיקי AAV נודדים למיקום בשיפוע המתאים לצפיפות הציפה שלהם¹⁴. חשוב לציין, תהליך זה יעיל בהפרדת קפסידים AAV מלאים (המכילים את המטען הגנטי) מקפסידים ריקים (חסרי חומר גנטי), שהוא גורם מכריע באיכות הווקטור. אופיו האיזו-אוסמולרי של יודיקסנול גם שומר על שלמות הקפסידים AAV טוב יותר מאשר סוכנים היפראוסמולרים כמו CsCl, מה שעשוי להוביל לתפוקה גבוהה יותר של וקטורים שלמים ופונקציונליים¹⁴. לבסוף, שיטות אולטרה-צנטריפוגות מסורתיות, במיוחד אלה המשתמשות בשיפועי CsCl, יכולות לפעמים לטהר במשותף מזהמים בעלי צפיפות ציפה דומה לווקטורים AAV¹⁵. על ידי שימוש במחיצות PEG כשלב מקדים, העומס של מזהמים כאלה מופחת באופן משמעותי לפני אולטרה-צנטריפוגה¹³. הפחתה זו בעומס המזהמים פירושה ששיפוע היודיקסנול יכול לעבוד בצורה יעילה וסלקטיבית יותר בטיהור וקטורי AAV, מה שמוביל לטוהר גבוה יותר¹⁵.

הטוהר והאיכות של וקטורי AAV מוערכים בקפדנות באמצעות צביעת כסף ו- TEM¹¹. התצפית של שלושה פסים עיקריים המתאימים לחלבוני קפסיד AAV VP1, VP2 ו- VP3, עם טוהר העולה על 90%, מצביעה על התאמתם של וקטורי AAV אלה לשימוש in vivo . ניתוח TEM לקביעת יחס קפסיד מלא לריק הוא חיוני במיוחד, שכן שיעור גבוה של קפסידים ריקים יכול להוביל ליעילות מופחתת של העברת גנים ולתגובות חיסוניות פוטנציאליות¹¹. בדיקת איכות זו, למרות שהיא חיונית, מוסיפה למורכבות הפרוצדורלית ועשויה לדרוש מומחיות טכנית נוספת.

לסיכום, הפרוטוקול מציע התקדמות טכנית משמעותית בייצור וקטורים AAV, במיוחד במונחים של מדרגיות וטוהר. עם זאת, המורכבויות הקשורות לתהליך הטיהור והצורך בציוד ומומחיות מיוחדים עשויים עדיין להוות מגבלה קלה ליישומו במסגרות מחקר מסוימות. חידוד נוסף ופישוט של טכניקות אלה יכול להפוך גישה זו לנגישה יותר וישימה באופן נרחב בתחום המחקר של ריפוי גנטי.

Materials

293T/17 cells	ATTC	CRL-11268
(NH4)2SO4	Millipore Sigma	1.01217.1000
0.5 M EDTA	MilliporeSigma	324506-100ml
1 mL Henke-Ject syringe	Fisher Scientific	14-817-211
10% pluronic F68 solution	Fisher Scientific	24-040-032
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Biorad	1610732
1M HEPES	Fisher Scientific	15-630-080
2% Uranyl Acetate Solution	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4%–20% Precast Protein Gels	biorad	4561094
40% PEG solution	Sigma	P1458-50ML
AAV6 reference full capsids	Charles River Laboratories	RS-AAV6-FL
Accutase Cell Detachment Solution	Fisher Scientific	A6964-100ML
Benzonase	Sigma	E1014-25KU
BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm	Fisher Scientific	12-556-003
Centrifugal Filter Unit	MilliporeSigma	UFC905024
Corning PES Syringe Filters	Fisher Scientific	09-754-29
Dialysis Cassettes, 10 K MWCO	Fisher Scientific	PI66810
Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 µm	Fisher Scientific	FB12566506
Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 µm	Fisher Scientific	FB12566507
Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 µm	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM high glucose	Fisher Scientific	10-569-044
DMEM low glucose	Fisher Scientific	10567022
DNase	NEB	M0303S
DPBS 1x	Fisher Scientific	14-190-250
Fetal Bovin Serum (FBS)	Biowest	S1620
Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu-50
glycerol	Sigma	G5516-1L
KCl	Sigma	P9541-500G
LB agar	Sigma	L2897-250G
LB broth	Fisher Scientific	BP9732-500
MgCL2·6H2O	Sigma	M9272-100G
NEB stable competent cells	NEB	C3040H
Nest Biofactory 10 chamber	MidSci	771302
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	740424
Opti-MEM	Fisher Scientific	31-985-088
OptiPrep Density Gradient Medium	Millipore Sigma	D1556-250ml
pAAV-CMV-GFP	Addgene	105530
pAAV-DJ	Cell BioLab	VPK-420-DJ
pAAV-RC6	Cell BioLab	VPK-426
pAdDeltaF6	Addgene	112867
PEG 8000	Promega	V3011
PEI Max	Polysciences, Inc	49553-93-7
Pen-Strep	Fisher Scientific	15-140-163
Phenol red	Millipore Sigma	1.07242.0100
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	24612
QuickSeal tube	Fisher Scientific	NC9144589
Sodium Chloride	Sigma	1162245000
sodium deoxycholate	Millipore Sigma	D6750-100G
Taqman Fast Advanced Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4444557
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor	Beckman Coulter	337922
Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32209