LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen en de validatie ervan
Summary
Dit protocol is gebaseerd op LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen. We gebruiken flowcytometrie om Annexine V en 7-AAD dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren, waarbij we de hele cel gebruiken en scanning-elektronenmicroscopie gebruiken om de morfologie van het celmembraan te observeren.
Abstract
Celdood is een fundamenteel proces in alle levende organismen. Het protocol stelt een door lipopolysaccharide (LPS) en adenosinetrifosfaat (ATP) geïnduceerde phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA)-gedifferentieerde lipideafzetting in humaan monocyt (THP-1) macrofaagmodel vast om celdood te observeren. LPS in combinatie met ATP is een klassieke inflammatoire inductiemethode, die vaak wordt gebruikt om pyroptose te bestuderen, maar apoptose en necroptose reageren ook op stimulatie door LPS/ATP. Onder normale omstandigheden is fosfatidylserine alleen gelokaliseerd in de binnenste blaadje van het plasmamembraan. In de vroege stadia van pyroptose, apoptose en necroptose blijft het celmembraan echter intact en wordt het blootgesteld aan fosfatidylserine, en in de latere stadia verliest het celmembraan zijn integriteit. Hier werd flowcytometrie gebruikt om de dubbele kleuring van Annexine V en 7-aminoactinomycine D (AAD) te analyseren om de celdood van de hele cellen te detecteren. De resultaten laten zien dat substantiële cellen stierven na stimulatie met LPS/ATP. Met behulp van scanning-elektronenmicroscopie observeren we de mogelijke vormen van celdood in individuele cellen. De resultaten geven aan dat cellen pyroptose, apoptose of necroptose kunnen ondergaan na stimulatie met LPS/ATP. Dit protocol richt zich op het observeren van de dood van macrofagen na stimulatie met LPS/ATP. De resultaten toonden aan dat celdood na LPS- en ATP-stimulatie niet beperkt is tot pyroptose en dat apoptose en necrotische apoptose ook kunnen voorkomen, waardoor onderzoekers celdood na LPS- en ATP-stimulatie beter kunnen begrijpen en een betere experimentele methode kunnen kiezen.
Introduction
Celdood is een fundamenteel fysiologisch proces in alle levende organismen. In de afgelopen jaren hebben substantiële studies aangetoond dat celdood betrokken is bij de immuniteit en het evenwicht binnen het organisme. Het bestuderen van celdood helpt ons het ontstaan en de ontwikkeling van ziekten beter te begrijpen. Er zijn verschillende vormen van geprogrammeerde celdood beschreven en enkele belangrijke doelen in deze processen zijn geïdentificeerd. Pyroptose, apoptose en necroptose zijn de drie genetisch gedefinieerde geprogrammeerde celdoodroutes die betrokken zijn bij intern evenwicht en ziekte1.
Pyroptose wordt gekenmerkt door de vorming van membraanporiën en het vrijkomen van celinhoud. Geactiveerde caspasen of granzymen splijten gasdermins om hun N-terminale domeinen te scheiden, die vervolgens oligomeriseren, binden aan het membraan en poriën vormen 2,3,4. De gasdermine-porie biedt een atypisch secretiekanaal over celmembranen, wat resulteert in stroomafwaartse celreacties, waaronder inhoudsafgifte en ioneninstroom 2,3,4. Uiteindelijk ervaren de cellen uiteindelijk plasmamembraanruptuur en pyroptotische lysis die wordt vergemakkelijkt door ninjurin-15. Bij apoptose vormen geactiveerde Bax en Bak oligomeren op het mitochondriale buitenmembraan en geven ze cytochroom C af, dat wordt gereguleerd door een evenwicht tussen proapoptotische en anti-apoptotische eiwitten van de BCL-2-familie, initiator-caspasen (caspase-8, -9 en -10) en effectorcaspasen (caspase-3, -6 en -7)1,6,7. De morfologische veranderingen van apoptose omvatten membraanblebbing, celkrimp, nucleaire fragmentatie, chromatinecondensatie en apoptotische lichaamsvorming 6,8. Het receptor-interagerende serine/threonine-proteïnekinase 1 (RIPK3) en mixed-lineage kinase domain-like (MLKL) zijn twee stroomafwaartse kerncomponenten van het necroptotische mechanisme1. RIPK3 rekruteert en fosforyleert MLKL, p-MLKL oligomeriseert, associeert met het celmembraan, initieert membraanperforaties, veroorzaakt ioneninstroom, verhoogt de intracellulaire osmolariteit en uiteindelijk celbreuk 6,9. Gasdermines en MLKL binden aan het plasmamembraan en mediëren respectievelijk pyroptose en necroptose, terwijl BAX/BAK apoptose bemiddelt door te binden aan het buitenmembraan van mitochondriën6.
Hoewel elke route specifieke mechanismen en resultaten heeft, leiden ze tot vergelijkbare veranderingen op het celmembraan. Onder normale omstandigheden is fosfatidylserine (PS) alleen gelokaliseerd in de binnenste blaadje van het plasmamembraan. In de vroege stadia van pyroptose, apoptose en necroptose zal PS echter buiten het plasmamembraan worden blootgesteld. Caspase-3/caspase-7 activeert de TMEM16- en XKR-families, wat leidt tot een asymmetrisch celmembraan en PS externaliseert tijdens apoptose10. Gasdermin D-gemedieerde en MLKL-gemedieerde Ca2+ influx leidt tot verlies van de symmetrie van de fosfolipide dubbellaag op het celmembraan en de blootstelling van PS. De blootstelling vindt plaats vóór het verlies van de integriteit van het celmembraan11,12. Op basis van de vergelijkbare veranderingen in het membraan van deze drie soorten geprogrammeerde celdood, gebruiken we flowcytometrie om Annexine V/7-Aminoactinomycine D (7-AAD) dubbele kleuring te analyseren om celdood te detecteren. Annexine V, een calciumafhankelijk fosfolipidebindend eiwit, heeft een hoge affiniteit voor PS, dat kan dienen als een gevoelige sonde om blootgestelde PS op het oppervlak van het plasmamembraan te detecteren13. 7-AAD is een nucleïnezuurkleuring die niet door het hele celmembraan kan gaan. Het is vergelijkbaar met propidiumjodide (PI), een veelgebruikte nucleïnezuurkleurstof. Ze hebben vergelijkbare fluorescentie-eigenschappen, maar 7-AAD heeft een smaller emissiespectrum en minder interferentie met andere detectiekanalen. Vanwege deze overeenkomsten is het niet voldoende om onderscheid te maken tussen pyroptose, apoptose en necroptose. We gebruikten flowcytometrie om de celdood van hele cellen te detecteren. Een tweede methode wordt gebruikt om het celmembraan vast te leggen met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM) om de mogelijke vormen van celdood in individuele cellen te observeren.
We hebben een door lipopolysaccharide (LPS) en adenosinetrifosfaat (ATP) geïnduceerde phorbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA)-gedifferentieerde lipideafzetting in humaan monocyt (THP-1) macrofaagmodel opgesteld om celdood te observeren. Dit protocol richt zich op het observeren van celdood in plaats van het onderzoeken van mechanismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript werden twee methoden gebruikt om LPS- en ATP-geïnduceerde dood van PMA-gedifferentieerde THP-1-macrofagen te detecteren. Annexine V/7-AAD dubbele kleuring werd gebruikt en de resultaten werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie van de algehele kleuring. Net als bij andere flowcytometrische analyse werden een groep ongekleurde cellen en twee groepen enkelvoudige cellen opgezet om vals-positieve en vals-negatieve resultaten uit te sluiten. De resultaten tonen aan dat na LPS/ATP-stimulatie versch…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We spreken onze grote waardering uit voor Jiayi Sun en Lu Yang van het Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, voor de hulp bij flowcytometrie, Cuiping Chen van het State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, voor de hulp bij scanning-elektronenmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China [82104491], de Natural Science Foundation of Sichuan [2023NSFSC0674] en de Post-doctoral Science Foundation of China [2021M693789].
Materials
| 0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA) | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0068 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | CORNING | 352235 | |
| 5 mL centrifuge tube | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-50-M | |
| 6-well plate | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 220100 | |
| Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit | Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd | abs50007 | Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution |
| celculture CO2 incubator | Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd. | N/A | |
| cell culture dish, 100 mm | Sorfa Life Science Research Co.,Ltd | 230301 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer K2 | |
| Cellometer SD100 Counting Chambers | Nexcelom Bioscience LLC | CHT4-SD100-002 | |
| centrifuge machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | L530 | |
| chromium alum | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA04354 | |
| cover glasses, 9 mm | Labgic Technology Co., Ltd. | BS-09-RC | |
| critical point dryer | Quorum Technologies | K850 | |
| dimethyl sulfoxide | BOSTER Biological Technology co.ltd | PYG0040 | |
| electron microscope fixative | Servicebio Technology co.ltd | G1102 | 2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts |
| electronic balance | SHIMADZU | ATX124 | |
| ethanol absolute | Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd | 2021033102 | |
| flow cytometer | Becton,Dickinson and Company | FACSCanto  |
|
| flow cytometry analysis software | Becton,Dickinson and Company | BD FACSDivaTM Software | |
| gelatin | Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd. | PA00256 | |
| High resolution cold field emission scanning electron microscope | TITACHI | Regulus 8100 | |
| human monocytic cell line THP-1 | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CL0233 | |
| inverted microscope | Leica Microsystems Co., Ltd | DMi1 | |
| IR Vortex Mixer | VELP Scientifica Srl | ZX4 | |
| lipopolysaccharide | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | L8880 | LPS is derived from Escherichia coli 055:B5 |
| Na2ATP | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | A8270 | |
| phorbol-12-myristate-13-acetate | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd. | P6741 | |
| phosphate-buffered saline | Servicebio Technology co.ltd | G4202 | |
| Pipette | Eppendorf AG | N/A | |
| pipette tips, 10 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-10PL | |
| pipette tips, 1 mL | Servicebio Technology co.ltd | T-1250L | |
| pipette tips, 200 μL | Servicebio Technology co.ltd | T-200L | |
| RPMI-1640 complete culture media | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd. | CM0233 | RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S |
| RPMI-1640 culture media | Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD. | K211104 | |
| sheath fluid | BECKMAN COULTER | 8546733 | |
| sputter coater | Cressington Scientific Instruments Ltd | 108 | |
| thermostatic water bath | GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd | HH-1 |
Referenzen
- Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
- Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
- Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803 (2023).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
- Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378 (2022).
- Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
- Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772 (2020).
- Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
- Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
- Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
- Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
- Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
- JoVE, Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , (2024).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
- Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
- Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
- Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
- Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48 (2018).
- Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830 (2022).
- Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233 (2018).
- Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689 (2019).
- Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
- Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515 (2015).
- Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
- Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529 (2024).
- Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
- Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244 (2023).
