Histoflow Cytometryによるハイパラメーター組織像の生成と解析
Summary
ここで説明するのは、免疫蛍光顕微鏡法により5つ以上の蛍光パラメータを画像化するために使用できる方法である。これらの画像から単一細胞を抽出し、フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を通じて単一細胞解析を実施するための解析パイプラインについて概説し、これにより組織切片の細胞サブセットを同定することができます。
Abstract
中枢神経系(CNS)に由来する組織切片などの免疫細胞の多様性を調査するための組織学の使用は、一度に画像化できる蛍光パラメータの数によって非常に制限されます。ほとんどの免疫細胞サブセットは、タンパク質マーカーの複雑な組み合わせを使用してフローサイトメトリーを使用して定義されており、最終的に同定するには4つ以上のパラメーターが必要になることが多く、これは従来のほとんどの顕微鏡の能力を超えています。フローサイトメトリーは組織を解離し、空間情報を失うため、複雑な細胞タイプの役割を調査しながら空間情報を保持できる技術が求められています。ここでは、スペクトル的に重なり合う蛍光色素のシグナルを収集し、スペクトルアンミキシングを使用して個々の蛍光色素分子のシグナルを分離することで、イメージングできる蛍光パラメーターの数を増やす方法を作成することで、これらの問題に対処します。次に、これらの画像を解析パイプラインを使用して処理し、ハイパラメーターの組織像を撮影し、これらの画像から単一細胞を抽出して、各細胞のユニークな蛍光特性を単一細胞レベルで分析できるようにします。フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を使用して、細胞をサブセットにプロファイリングし、組織学セクションにマッピングして、その存在量を定量化するだけでなく、組織環境とどのように相互作用するかを確立することができます。全体として、組織学切片の複雑な免疫集団を研究するためにヒストフローサイトメトリーを使用することの単純さと可能性が実証されています。
Introduction
免疫系の細胞とグリア細胞によって引き起こされる炎症は、各集団が他の1,2,3の活性を促進することができるCNSの慢性障害に寄与する可能性があります。免疫系がCNSのこれらの要素とどのように相互作用してCNSの炎症を促進するかを理解することは、現在主要な関心事であり、シングルセルRNAシーケンシングなどのハイパラメーター技術によって大幅に促進されています。シングルセルRNAシーケンシングを通じて、いくつかのCNS疾患において、グリア細胞と免疫系との間に広範なコミュニケーションが起こっていることを発見しました4,5,6。これらの相互作用がこれらの疾患にどのように影響しているかを理解することは、これらの疾患の生物学を解明するために非常に重要です。
シングルセルシーケンシング解析の問題点の1つは、これらの技術では、シングルセルまたは核を得るために組織を破壊する必要があり、その結果、空間情報が完全に失われることです。細胞が組織内のどこに存在するかを知ることは、炎症を引き起こす細胞の役割を理解するために重要です。例えば、B細胞などの免疫細胞は、神経炎症中にCNSに集中することができる。しかし、彼らはめったにCNS実質に入ることはなく、代わりにCNSバリア7に集中します。その局在性を考えると、これらの細胞がCNS実質のグリア細胞と物理的に相互作用することによってCNS炎症に寄与している可能性は低く、グリア細胞との相互作用は分泌因子を介して起こることが示唆されています。さらに、CNS障害で発生する病理は、多くの場合、組織内での細胞の局在化が、それが障害に積極的に寄与しているのか、それとも傍観者なのかを決定的に判断できるように、構造8,9を持っています。したがって、病理学における細胞の役割を評価するために空間的オリエンテーションを使用することが不可欠である。
組織中の細胞の研究は、通常、免疫組織化学または免疫蛍光顕微鏡を使用して行われてきました。これらの手法の問題は、通常、同時に最大4つのパラメータしか画像化できないことです。フローサイトメトリーやシングルセルRNAシーケンシング解析から、多くの細胞集団が同定のために2つ以上のパラメータを必要とすることがわかっているため、これはこれらの技術の大きな制限です。また、必要なパラメータの数は、通常、セルタイプ10の特定のサブセットを探すときに増加します。したがって、細胞のサブセットが組織内でどのように相互作用しているかを研究するために、標準的なイメージング技術を使用することは現実的ではありません。
この問題は、空間的RNAシーケンシング11やイメージングマスサイトメトリー12など、空間情報を保持できる新しいハイパラメータ法によって部分的に克服されています。これらの手法は価値がありますが、広く利用されていない、3 次元データを 2 次元に縮小する、実行するにはかなりの専門知識が必要になるなど、いくつかの問題があります。逐次染色として知られる別の技術は、組織を1セットの抗体で染色し、続いて前の抗体セットを不活性化してから別の抗体セットで染色するというもので、特殊な機器や専門知識を必要とせずにハイパラメーターの組織型検査を達成できる13,14,15.しかし、逐次染色は非常に手間がかかり、顕微鏡観察に長時間かかるため、個人用顕微鏡を所有していない研究室では実用的ではありません。そのため、広く利用可能な顕微鏡で一度にイメージングできる蛍光パラメータの数をタイムリーに拡大できる技術が求められています。
ハイパラメータデータを取得すると、従来の画像解析方法ではデータの解析がうまくいかないという別の問題が発生します。手動カウントやしきい値処理などの手法は、解析が 1 つのパラメーターで構成されている場合、または複数のマーカーが同じ位置を特定し、重複する信号のみがカウントされる場合にのみ実行可能です。この制限により、従来の分析では高パラメーターのデータセットを操作できなくなりました。これらのデータセットの解析は、組織像から単一細胞をセグメント化し、次いで細胞型を同定するためのフローサイトメトリー様ゲーティング戦略を実施することによって達成された16,17。しかし、これらの解析に影響を与える別の問題は、これらの手法では物理的に接触している細胞を正確に分離できる方法を採用していないため、対象のすべての細胞が物理的に分離されているデータセットでのみ機能することです。そのため、細胞が物理的に接触している場合でも、組織切片のシングルセル解析を行うことができる新しい方法が求められています。
この記事では、以前に紹介された18 、広く利用可能な顕微鏡を使用して同時にイメージングできる蛍光パラメータの数を増やす、ヒストフローサイトメトリーと呼ばれる簡単なプロトコルについて説明します。このプロトコールは、スペクトル的に重なり合う色素で組織を染色し、スペクトル補償を使用して重なり合うチャネルからブリードスルーを除去し、明確な単一染色を得ることによって機能します。ハイパラメータ組織像の解析を容易にするために、フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を用いて細胞を異なる集団に選別する目的で、組織切片から単一細胞を抽出する詳細な解析パイプラインが記載されている。このプロトコルは、細胞がびまん性して存在する組織や、細胞が密接に圧縮されている組織で機能するため、この技術は、恒常性と神経炎症の両方におけるCNSのような組織の研究に汎用性があります。したがって、Histoflow Cytometryは、空間情報を維持しながら細胞を定義するために複数の細胞マーカーを必要とする複雑な細胞タイプ間の相互作用を研究するための有用な技術です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、以前に検証された技術である組織流サイトメトリーの使用について説明します18。スペクトル的に重なり合う色素で組織切片を染色すると、スペクトル補償を使用してチャネルをまたいだブリードスルーを除去できるため、従来の方法よりも多くの蛍光パラメータが明確に分離されることが実証されています。従来の方法ではハイパラメータの組織像の解析が難?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hotchkiss Brain Institute Advanced Microscopy Platformのイメージングインフラストラクチャと専門知識に感謝します。RWJは、カルガリー大学アイズハイプログラムからのポスドクフェローシップの資金提供と、カナダの多発性硬化症協会およびロシュカナダの無制限の教育フェローシップによって支援されました。VWYは、Canada Research Chair Tier 1プログラムから給与支援を受けました。この研究は、Canadian Institutes of Health Research Grant 1049959、Canada Multiple Sclerosis Society of Canada Grant 3236、および米国国防総省のCongressionally Directed Multiple Sclerosis Research Programからの運営資金によって支援されました。 図 1 は BioRender.com を使用して作成されています。この出版物で採用された数値は、もともと The Journal of Immunologyに掲載されました。ラジブ・W・ジェイン、デビッド・A・エリオット、V・ウィー・ヨン。2023. Histoflow Cytometryを使用したハイパラメータ組織像のシングルセル解析。 J.イムノール。210: 2038-2049.著作権 © [2023]。米国免疫学会
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
Referenzen
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