Evoluzione molecolare del ricombinasi Tre

Summary

Qui riportiamo la generazione di Tre ricombinasi attraverso la regia, l'evoluzione molecolare. Tre ricombinasi riconosce un pre-definito sequenza bersaglio all'interno della sequenza LTR di HIV-1 provirus, con la conseguente escissione e l'eradicazione del provirus infette da cellule umane. Mentre ancora nella sua infanzia, per la regia evoluzione molecolare consentirà la creazione di enzimi personalizzati che fungeranno da strumenti di chirurgia molecolare e medicina molecolare.

Abstract

Qui riportiamo la generazione di Tre ricombinasi attraverso la regia, l'evoluzione molecolare. Tre ricombinasi riconosce un pre-definito sequenza bersaglio all'interno della sequenza LTR di HIV-1 provirus, con la conseguente escissione e l'eradicazione del provirus infette da cellule umane.

Abbiamo iniziato con Cre, una 38-kDa ricombinasi, che riconosce un 34-bp a doppio filamento sequenza di DNA conosciuto come loxP. Cre perché possono effettivamente eliminare sequenze genomiche, abbiamo deciso di personalizzare un ricombinasi che potrebbe togliere la sequenza tra il 5'-LTR e 3'-LTR di un sistema integrato di HIV-1 provirus. Come primo passo abbiamo individuato le sequenze all'interno dei siti LTR che erano simili a loxP e testati per l'attività di ricombinazione. Inizialmente Cre e mutagenizzate librerie Cre non è riuscito a ricombinare i siti loxLTR scelto di HIV-1 provirus. Come l'inizio di ogni processo di evoluzione molecolare diretto richiede almeno attività residua, le sequenze originali loxLTR asimmetrico sono stati suddivisi in sottogruppi e testati di nuovo per l'attività di ricombinazione. Agendo come prodotti intermedi, attività ricombinazione è stata dimostrata con i sottoinsiemi. Successivamente, le biblioteche ricombinasi erano arricchiti attraverso cicli di evoluzione ripetitive. Successivamente, arricchito le biblioteche sono state mescolate e ricombinati. La combinazione di mutazioni diverse dimostrato sinergico e ricombinasi sono stati creati, che sono stati in grado di ricombinare loxLTR1 e loxLTR2. Questo è stato dimostrato che una strategia evolutiva attraverso intermedi può avere successo. Dopo un totale di 126 cicli di evoluzione ricombinasi individuali erano funzionalmente e strutturalmente analizzati. La ricombinasi più attivi – Tre – aveva 19 cambiamenti di aminoacidi rispetto al Cre. Tre ricombinasi è stato in grado di asportare il provirus di HIV-1 dal genoma di HIV-1 le cellule infettate HeLa (vedi "HIV-1 DNA provirale escissione Utilizzando un ricombinasi Evolved", Hauber J., Heinrich-Pette-Istituto di Virologia e Immunologia Sperimentale, Amburgo, Germania). Mentre ancora nella sua infanzia, per la regia evoluzione molecolare consentirà la creazione di enzimi personalizzati che fungeranno da strumenti di "chirurgia molecolare" e medicina molecolare.