Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine vollständige Durchtrennung des Rückenmarks bei der Larve des Zebrafisches durch einen relativ hohen Durchsatz und eine reproduzierbare Methode sicherzustellen und gleichzeitig das Überleben zu maximieren. Dies wird erreicht, indem adulte Tiere des entsprechenden Genotyps zunächst verpaart und bei Bedarf ein Screening durchgeführt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Embryonen bis fünf Tage nach der Befruchtung aufzuziehen.

Führen Sie anschließend die Durchtrennung mit einer abgeschrägten Mikroinjektionspipette durch. Schließlich dürfen sich die verletzten Fische bis zum Ende des Versuchs in mit Antibiotika behandelten Medien erholen. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Reaktion der neuronalen Vorläuferzellen auf Verletzungen zu zeigen.

Zu den Hauptvorteilen dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie sie von den Becker- und Holper-Labors entwickelt wurden, gehören eine größere Anzahl von Tieren zur Untersuchung, eine kürzere Erholungszeit und die Verwendung genetischer Werkzeuge, die sonst beim erwachsenen Zebrafisch nicht verfügbar sind. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Regeneration zu beantworten, wie z. B. die Reaktion des neuronalen Vorläufers auf Verletzungen. Beginnen Sie mit den Vorbereitungen mit der Herstellung von Operationsplatten aus 60-Millimeter-Petrischalen und dem Silikonelastomer-Kit Cell Guard 180 4.

Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Füllen Sie die Schalen nicht mehr als zur Hälfte und lassen Sie sie polymerisieren. Lagern Sie das Geschirr dann abgedeckt bei Raumtemperatur.

Als nächstes stellen Sie Mikropipetten her, indem Sie dünnwandige Bo-Silikat-Kapillarschläuche in einer Mikropipette polar erhitzen und ziehen, wobei die gleichen Einstellungen verwendet werden, die für die Herstellung von Mikroinjektionsnadeln unter einem Dissektionsmikroskop verwendet werden. Brechen Sie die Spitze der Mikropipette mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von etwa 200 Mikrometern ab. Dann fasen Sie die gebrochene Kante mit einem Mikroschleifer zunächst auf 35 Grad ab, gefolgt von einer zweiten Abschrägung um 25 Grad, wenn das Schleifgeräusch aufhört.

Überprüfen Sie unter einem Präpariergerät, ob die Spitze scharf und glatt ist. Die Verwendung einer zu breiten Spitze führt tendenziell zu höheren Todesfällen, da die Wahrscheinlichkeit eines Einkerlens der dorsalen Aorta erhöht ist. Während eine zu schmale Spitze eher dazu neigt, von der Haut abzublicken, als das Gewebe zu schneiden, bewahren Sie die korrekt abgeschrägten Mikropipetten sieben Tage vor der Operation in einer Petrischale auf einer kleinen Menge Tonerde auf.

Richten Sie Paarungsbecken mit männlichen und weiblichen Sprossen ein. Die Fische sammeln die befruchteten Embryonen am nächsten Morgen, drei Stunden nachdem das Licht angeschaltet ist. Um maximalen Ertrag zu gewährleisten.

Wenn Sie eine transgene Reporterlinie mit gemischten Genotypen verwenden, setzen Sie 100 Embryonen pro Platte und inkubieren Sie die Platten bei 28,5 Grad Celsius. Bei Verwendung einer Reporterlinie werden die Embryonen nach 48 Stunden auf Fluoreszenzexpression untersucht. Nach der Befruchtung.

Lassen Sie die fluoreszierenden Embryonen bei 28,5 Grad Celsius reifen, wenn die Larven geboren werden, oder fünf Tage nach der Befruchtung. Bereiten Sie die Operationsplatte vor, indem Sie den Zellschutz mit E zwei und 10 Milligramm pro Liter, Gentamicinsulfat und Trica bedecken. Bereiten Sie zusätzlich eine Auffrischungsschale vor, indem Sie 25 Milliliter E two und Gentamycinsulfat in eine 100-Millimeter-Petrischale geben.

Der nächste Schritt besteht darin, einen Skalpellgriff vorzubereiten, indem drei Tupfer zusammengeklebt werden. Dadurch entsteht ein dreieckiges Werkzeug mit drei Rillen. Montieren Sie als Nächstes die vorbereitete Mikropipette auf die Tupfer, indem Sie sie in eine der Rillen kleben, um das Skalpell zu vervollständigen, und legen Sie die Mikropipette bis zur Verwendung beiseite.

Beginnen Sie die Operation, indem Sie jeweils eine Platte mit 25 Larven betäuben. Mit trica werden die Fische ausreichend betäubt, wenn sie keine Berührungsreaktion mehr zeigen. Übertragen Sie die Larven auf eine Operationsplatte und legen Sie die Platte unter ein Präpariermikroskop.

Drehen Sie bei maximaler Vergrößerung eine Larve so, dass sie auf der Seite liegt und den Rücken am nächsten an der Hand hält, die das Skalpell hält. Positionieren Sie die Pinzette so, dass sie auf dem Zellschutz aufliegt. Über die Breite der Larven abgewinkelt, das Glasskalpell gegen einen der Arme der Pinzette stützend.

Schneiden Sie in die dorsale Seitenfläche der Larven auf Höhe der Analpore. Achten Sie darauf, nicht über den ventralen Rand der Nabelschnur hinaus zu schneiden. Drehen Sie dann das Skalpell, um das Rückenmark zu durchtrennen.

Die erforderliche Verdrehung beträgt in der Regel deutlich weniger als 90 Grad. Wiederholen Sie die Rückenmarksdurchtrennung mit den restlichen Larven. Sobald die Operation an der Larvencharge abgeschlossen ist, verwenden Sie eine hintere Pipette und eine Pipettenpumpe, um die verletzten Tiere auf die Auffangplatte zu übertragen.

Um die Narkose zu beenden, stellen Sie sicher, dass Sie während des Transfers zuerst den Kopf oder Schwanz der Larve sammeln. Belasten Sie die Verletzungsstelle nicht, indem Sie die Larven nach Abklingen der Narkose verbiegen. Übertragen Sie die verletzten Larven von der Auffangplatte auf die 100-Millimeter-Platten, die mit 25 Millilitern E two und Gentamycinsulfat in einer Dichte von 25 Larven pro Platte gefüllt sind.

Legen Sie sie dann in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, während die Wunde heilt. Überprüfen Sie die Platten täglich. Entfernen von kranken oder toten Tieren.

Wechseln Sie das Medium erst, wenn die Süßwasser-Protozoenställe auf dem Medium sichtbar sind. Füllen Sie den Fisch beim Wechseln des Mediums nicht auf einen neuen Teller um. Entfernen Sie stattdessen so viele Medien wie möglich und überfluten Sie dieselbe Platte mit neuen Medien.

Wiederholen Sie den Medienwechsel bei Bedarf, um die Stallpopulation zu reduzieren. Füttern Sie die Larven täglich mit einer kleinen Menge Jungfischpulver in Pulverform. Ein Zebrafisch mit einem komplett durchtrennten Rückenmark ist hier an einem Tag zu sehen.

Nach der Verletzung wird GFP in allen Neuronen exprimiert, und der gelbe Pfeil kennzeichnet die Verletzungsstelle. Ein Zebrafisch mit einem vollständig durchtrennten Rückenmark ist hier drei Tage nach der Verletzung drei Tage nach der Verletzung zu sehen. Dieser fixierte UCD-markierte Zebrafisch zeigt ein vollständig durchtrenntes Rückenmark.

Der gelbe Pfeil zeigt wieder die Verletzungsstelle. Im Gegensatz dazu ist die zusammenhängende Region der Neuronenmarkierung entlang des ventralen Randes des Rückenmarks. In diesen drei Tagen nach der Verletzung weist der fixierte Zebrafisch auf eine unvollständige Durchtrennung hin.

Einmal gemeistert, können mit dieser Technik 300 Larven pro Stunde verarbeitet werden.