Ensayos enzimáticos y cinética
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Cinética de la enzima describe los efectos catalíticos de las enzimas, que son biomoléculas que facilitan las reacciones químicas necesarias para los organismos vivos. Las enzimas actúan sobre moléculas, contempladas como sustratos a los productos de la forma. Parámetros cinéticos de la enzima se determinan mediante ensayos que directa o indirectamente medir los cambios en la concentración de substrato o producto con el tiempo.
Este video cubre los principios básicos de la cinética de la enzima (incluyendo las ecuaciones de velocidad) y modelos cinéticos. También se discuten los conceptos que rigen los ensayos enzimáticos, seguido por un típico análisis colorimétrico. Aplicaciones discute un análisis enzimático mediante el análisis de la transferencia (traste) de Förster Resonancia energética, caracterización de la actividad enzimática extracelular en el medio ambiente, y sondas de investigación ADN reparación cinética utilizando molecular.
Las enzimas son catalizadores bioquímicos que son esenciales para la vida. Análisis de enzima se utilizan para estudiar las propiedades cinéticas de reacciones enzimáticas, elucidar los efectos catalíticos de las enzimas. Este video cubre cinética de la enzima y ensayos, pasar de un procedimiento general y mostrar algunas aplicaciones.
Las enzimas son proteínas o moléculas similares a proteínas que actúan sobre una molécula de reactivo, conocida como el substrato. Las enzimas reducen la energía de activación de reacciones bioquímicas. Esto permite que las reacciones que se producen a mayor velocidad con menos requisitos de energía.
Reacciones enzimáticas pueden dividirse en tres componentes elementales. La primera es la formación de la enzima-sustrato complejo, formado por la Unión del sustrato al sitio activo de enzima. El complejo puede descomponerse en sus componentes originales. Esta es la segunda reacción elemental. Alternativamente, el complejo puede formar el producto y recuperar la enzima, la tercera reacción elemental.
La cinética de una reacción elemental es dada por la ecuación de la ley de tasa primaria. Ecuaciones de la ley de velocidad dan la tasa en términos de la concentración de los reactivos y una constante de velocidad. Cada una de las reacciones elementales tiene una ecuación de la ley de tarifa por persona, con su propia constante de velocidad. Estas ecuaciones pueden ser destiladas a un modelo cinético que se conoce como la ecuación de Michaelis-Menten. Esto le da la velocidad de reacción en términos de la concentración de sustrato; que puede ser determinada experimentalmente. Algunas tendencias generales de reacciones enzimáticas pueden ser identificados utilizando la ecuación de Michaelis-Menten. A concentración de sustrato alta, un punto de saturación se alcanza, llama Vmax. Aquí, la velocidad está limitada por la concentración total de enzima, y el número de moléculas de sustrato una enzima convierte en producto por momento, también conocido como kcat. De Michaelis-Menten cinética kcat es una de las dos constantes que rigen la velocidad de reacción. La constante KM, es conocida como la constante de afinidad. KM es también equivalente a la concentración donde la velocidad de reacción es equivalente a la mitad de la Vmax. Una enzima con una afinidad más alta tendrá una KM baja y llegar a la Vmax más rápido, mientras que una enzima con baja afinidad se tiene un alto KM y tardan más en llegar a la Vmax. Saber kcat y KM permite enzimas para compararse. Para ello utilizamos un ratio denominado eficiencia enzimática. Kcat mayor y menor KM como resultado una mayor eficiencia, menor kcat y más resultados KM en bajo.
Los factores utilizados para dilucidar la cinética de la enzima deben ser determinados experimentalmente. Estos ensayos se realizan típicamente mediante la mezcla de una solución de enzima y de sustrato en un ambiente controlado. Se realizan observaciones, midiendo los cambios en la concentración del sustrato, productos o subproductos con respecto al tiempo.
El cambio en la concentración con el tiempo se utiliza para determinar la velocidad de reacción. Para determinar la cinética, tarifa de datos se debe obtener en varias concentraciones. Si una parcela de la tasa inicial inversa vs concentración inicial inversa, conocido como el diagrama de Lineweaver-Burk, es lineal, entonces la reacción sigue la cinética de Michaelis-Menten. La pendiente y el intercepto de la línea permiten la determinación de los parámetros cinéticos KM y Vmax, que luego puede utilizarse para calcular kcat y la eficacia de la enzima.
Ahora que se han discutido los principios de la cinética de la enzima, echemos un vistazo a cómo se realiza un análisis de enzima típica.
En este procedimiento se demuestra un análisis colorimétrico. El primer paso es generar una curva estándar, que se correlaciona la absorbancia con la concentración de proteína. Soluciones de concentración conocida se preparan junto con una muestra de control. Se añade una solución de revelador que reacciona con la proteína diana para producir un compuesto coloreado. La absorbancia es medida y conspiró contra la concentración para generar la curva estándar.
Para realizar el ensayo, se prepara una concentración conocida de sustrato junto con la cantidad adecuada de enzimas. El enzima y el substrato se mezclan y permitió a incubar durante un intervalo de tiempo. pH y la temperatura se controlan con soluciones tampón y bloques de calefacción. Se agrega un agente de amortiguamiento para detener la reacción. Solución de revelado entonces se añade a las reacciones y mezclado. Las soluciones se colocan en cubetas y se mide la absorbancia. La cantidad de sustrato consumido se determina mediante la comparación de la absorbancia medida a la curva estándar. Utilizando los datos recogidos, se determinan velocidades de reacción inicial de concentración con el tiempo. Finalmente, con la tarifa de datos y la concentración, se hace la trama de Michaelis-Menten. Esto permite la determinación de las propiedades cinéticas de la enzima como número y enzima la eficiencia de facturación.
Ahora que hemos revisado un procedimiento de análisis, veamos otras formas se realizan ensayos y sus aplicaciones.
En este procedimiento traste análisis se utilizan para estudiar la cinética de una proteasa hidrolizando un enlace peptídico de una proteína. Estas emisiones pueden medirse, lo que permite un análisis continuo y cuantitativo de la producción y el consumo de sustrato, ayudar en la determinación de la cinética de la reacción.
Análisis de enzima se pueden utilizar en ciencias ambientales para determinar los niveles de actividad enzimática extracelular en el medio ambiente. Aguas, suelos y sedimentos pueden recogidos del ambiente y procesados en el laboratorio. Actividad enzimática extracelular de estos materiales se puede caracterizar entonces mediante pruebas enzimáticas. Se trata de una herramienta útil para la comprensión de cómo el medio ambiente procesos de material orgánico.
Mecanismo de reparación de ADN de una célula puede evaluarse mediante el estudio de la cinética de enzimas encontradas en el núcleo. La tasa en la que una enzima elimina daños, o lesiones del ADN puede medirse utilizando balizas moleculares fluorescentes, que sólo es fluorescente cuando ligada a secuencias de ADN únicas. El nivel de reparación del ADN se puede medir en tiempo real mediante la detección de los productos de fluorescencia marcado escote.
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Verfahren
Offenlegungen
Transkript
Enzymes are biochemical catalysts that are essential for life. Enzyme assays are used to study the kinetic properties of enzymatic reactions, elucidating the catalytic effects of enzymes. This video will cover enzyme kinetics and assays, go over a general procedure, and show some applications.
Enzymes are proteins, or less often RNAs, that act on a specific reactant, referred to as the substrate. An enzyme reduces the activation energy needed to initiate a biochemical reaction, causing the reaction to occur at a faster rate.
Enzymatic reactions can be broken up into three elementary components. The first is the formation of the enzyme-substrate complex, formed by the binding of the substrate to the enzyme active site. The complex can decompose into its original constituents. This is the second elementary reaction. Alternatively, the complex can form the product and recover the enzyme, the third elementary reaction.
The kinetics of an elementary reaction is given by the elementary rate law equation. Rate law equations give the rate in terms of the concentration of the reactants and a rate constant. Each of the elementary reactions has an individual rate law equation, with its own rate constant. These equations can be distilled down to a kinetic model known as the Michaelis-Menten equation. This gives the reaction rate in terms of the substrate concentration; which can be experimentally determined. Some general trends for enzyme reactions can be identified using the Michaelis-Menten equation. At high substrate concentration, a saturation point is reached, called Vmax. Here, the rate is limited by the total enzyme concentration, and the number of substrate molecules an enzyme converts into product per given time, also known as kcat. In Michaelis-Menten kinetics kcat is one of the two constants that govern reaction rate. The other constant, KM, is known as the affinity constant. KM is also equivalent to the concentration where the reaction rate is equivalent to one-half Vmax . An enzyme with a higher affinity will have a lower KM and reach Vmax faster, while an enzyme with lower affinity will have a higher KM and take longer to reach Vmax. Knowing kcat and KM allows for enzymes to be compared. To do this we use a ratio called enzyme efficiency. Higher kcat and lower KM result in higher efficiencies, while lower kcat and higher KM results in lower.
The factors used to elucidate enzyme kinetics must be determined experimentally. These assays are typically performed by mixing an enzyme and substrate solution in a controlled environment. Observations are made by measuring the changes in concentration of the substrate, product, or byproducts with respect to time.
The change in concentration over time is used to determine the reaction rate. In order to determine the kinetics, rate data must be obtained at multiple concentrations. If a plot of the inverse initial rate vs. inverse initial concentration, known as the Lineweaver-Burk plot, is linear, then the reaction follows Michaelis-Menten kinetics. The slope and intercept of the line allow for the determination of the kinetic parameters KM and Vmax, which can then be used to calculate kcat and the enzyme efficiency.
Now that the principles of enzyme kinetics have been discussed, let’s look at how a typical enzyme assay is performed.
In this procedure a colorimetric assay is demonstrated. The first step is to generate a standard curve, which will correlate absorbance with substrate concentration. Solutions of known concentration are prepared along with a control sample. A developer solution that reacts with the substrate is added to produce a colored compound. Absorbance is measured and plotted against concentration to generate the standard curve.
To perform the assay, a known concentration of substrate is prepared along with the appropriate amount of enzyme. The enzyme and substrate are mixed and allowed to incubate for a set time interval. pH and temperature are controlled with buffer solutions and heating blocks. A quenching agent is added to stop the reaction. Developer solution is then added to the reactions and mixed. The solutions are then placed in cuvettes and absorbance is measured. The amount of substrate consumed is determined by comparing the measured absorbance to the standard curve. Using the collected data, initial reaction rates are determined by plotting concentration over time. Finally, with the rate data and concentration, the Michaelis-Menten plot is made. This allows for the determination of kinetic properties for the enzyme such as turnover number and enzyme efficiency.
Now that we’ve reviewed an assay procedure, let’s look at other ways assays are performed and their applications.
In this procedure FRET analysis is used to study the kinetics of a protease hydrolyzing a peptide bond of a protein. These emissions can be measured, allowing for a continuous and quantitative analysis of substrate consumption and production, aiding in the determination of the reaction kinetics.
Enzyme assays can be used in environmental science to determine the levels of extracellular enzyme activity in the environment. Waters, soils, and sediments can be collected from the environment and processed in the laboratory. Extracellular enzymatic activity of these materials can then be characterized using enzyme assays. This is a useful tool for understanding how the environment processes organic material.
A cell’s DNA repair mechanism can be evaluated by studying the kinetics of enzymes found in the nucleus. The rate at which an enzyme removes DNA lesions, or damages, can be measured using fluorescent molecular beacons, which only fluoresce when bound to unique DNA sequences. The level of DNA repair can be measured in real time by detecting the fluorescently labeled cleavage products.
You’ve just watched JoVE’s video on enzyme kinetics and assays. This video explained enzyme kinetics, covered assay concepts, went over a general procedure, and described some applications.
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