Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha
Summary
Indução neural é o primeiro passo na formação do cérebro. É um mecanismo pelo qual o nó de Hensen (organizador), instrui tecido adjacente a adotar um destino neural, ou seja, dar origem ao sistema nervoso. Este vídeo demonstra um ensaio para a indução neural no embrião de galinha.
Abstract
O embrião de galinha é uma ferramenta valiosa no estudo do desenvolvimento embrionário precoce. Sua transparência, acessibilidade e facilidade de manipulação, torná-lo uma ferramenta ideal para estudar a formação inicial e padronização do sistema nervoso. Este vídeo demonstra como organizador do enxerto de tecido em um host, um método pelo qual nó s Hensen (o organizador do embrião de galinha) é enxertado em um ectoderma competente de acolhimento. O enxerto organizador instrui sobrejacente nd ve tecido de adotar um destino através de sinais neurais indução neural. Esse mecanismo é conhecido como indução neural, e constitui o passo inicial na formação do cérebro e da medula espinhal em amniotas. Este método é essencialmente utilizado para a caracterização de moléculas indução neural putativo no pinto. Este vídeo demonstra as diferentes etapas no ensaio para a indução neural; Primeiro, o embrião é Donnor explantado e colocou em um prato. Então, o embrião hospedeiro está preparado para a nova cultura. O enxerto é retirado e transplantado para o host margem área pelúcida. O host é cultivado para 18-22 hrs. A montagem é fixa e processados para outras aplicações (por exemplo, hibridização in situ). Este método foi originalmente concebido por Waddington<sup> 1,2</sup> E Gallera<sup> 3,4</sup>.
Protocol
Discussion
Este vídeo demonstra as diferentes etapas na realização de um ensaio para a indução neural; Este ensaio é essencialmente usado para a caracterização da suposta indução neural em moléculas de bico, e, portanto, pode ser usado para uma ampla variedade de aplicações, que vão desde micromanipulations embriológico 1-4; 6 a desvendar novas cascatas de sinalização 7,8, todas visando a compreensão da etapa inicial na formação do cérebro e restante do sistema nervoso.
Acknowledgements
DP é destinatário de Ruth Award Kirschstein DA021977 1F32-01A1 do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas. Este trabalho foi financiado pela M. Margaret Alkek Fundação RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma | A5177-5EA | |
| Microelectrode puller | Equipment | Sutter Instruments | Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
Referencias
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
