Assay עבור אינדוקציה עצבית בעובר צ'יק
Summary
אינדוקציה עצבית היא הצעד הראשון ביצירת המוח. זהו המנגנון שבאמצעותו הצומת של Hensen (מארגן), מורה רקמות סמוכות לאמץ גורל עצביים, כלומר להצמיח מערכת העצבים. וידאו זה מדגים assay לזירוז העצבית בעובר האפרוח.
Abstract
עובר אפרוח הוא כלי רב ערך במחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. שקיפות, שלה נגישות וקלות מניפולציה, ולהפוך אותו כלי אידיאלי לחקר היווצרות דפוסים הראשונית של מערכת העצבים. סרט הווידאו הזה מדגים כיצד רקמה מארגן השתל לתוך לארח, שיטה שבאמצעותה הצומת s Hensen (מארגן בעובר האפרוח) היא מורכבים כדי האאקטודרם מארח המוסמכות. שתל מארגן מורה שמעל na יש רקמת לאמץ גורל אותות עצביים באמצעות גרימת עצביים. מנגנון זה נקרא אינדוקציה עצביים, ומהווה את השלב הראשוני להיווצרות של המוח וחוט השדרה ב אמניוטים. שיטה זו משמשת בעיקר לאפיון המשוערת של מולקולות גרימת עצבית חומוס. סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים assay לזירוז עצביים; ראשית, העובר donnor הוא explanted והצמיד על צלחת. ואז, העובר מארח מוכן תרבות חדשה. השתל הוא נכרת ו להשתיל את השוליים באזור המארח pellucida. המארח הוא תרבותי עבור 18-22 שעות. הרכבה הוא קבוע מעובד עבור יישומים נוספים (למשל הכלאה באתרו). שיטה זו פותחה במקור על ידי וודינגטון<sup> 1,2</sup> ו Gallera<sup> 3,4</sup>.
Protocol
Discussion
סרט הווידאו הזה מדגים את השלבים השונים בביצוע assay לזירוז עצביים; זה assay משמש בעיקרו על אפיון של המשוערת מולקולות גרימת עצבית חומוס, וכך ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, החל micromanipulations העוברית 1-4; 6 אל מפלי נפרמים חדש איתות 7,8, כולם במטרה להבין את השלב הראשונ?…
Acknowledgements
DP הוא חתן פרס רות Kirschstein DA021977 1F32-01A1 מן המכון הלאומי האמריקני לשימוש בסמים. עבודה זו נתמכה על ידי מ 'מרגרט Alkek קרן אל RHF.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma | A5177-5EA | |
| Microelectrode puller | Equipment | Sutter Instruments | Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
Referencias
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
