0.22μmのSterivexフィルタおよび塩化セシウム密度勾配遠心分離からのDNA抽出
Summary
我々は、精製のための塩化セシウム密度勾配遠心分離に続いて0.22μmのSterivexフィルタ、集中プランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAの抽出のための方法を説明します。
Abstract
このメソッドは、ストレージ/溶解緩衝液で処理し、-80℃でアーカイブされている0.22μmのSterivexフィルターに集中してプランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAを抽出し、塩化セシウムの密度勾配を用いてこのDNAを精製するために使用されます。プロトコルは、細胞からDNAを解放し、RNAを除去する2つの1時間のインキュベーションステップから始まります。次に、フェノールのシリーズ：クロロホルム及びクロロホルム抽出は、抽出液を洗浄し、集中するタンパク質や細胞膜の成分、水溶性のDNA抽出物の収集、およびいくつかのバッファの交換の手順を除去するために遠心分離に続いて実行されます。パート5は、塩化セシウムの密度勾配を経由して任意の精製について説明します。それは混乱を避けるために、プロトコルのダウンタイムを削減するために一度に15未満のサンプルで動作することをお勧めします。このプロトコルに必要な総時間は、抽出するサンプル数に依存します。 10月15日のサンプルと、適切な遠心分離装置が使用可能であると仮定するため、このプロトコル全体では3日かかります。あなたがプロセスの開始時に温度に設定されてハイブリダイゼーションオーブンを持っていることを確認します。
Protocol
Discussion
処理される方法を多くのサンプルであることに応じて、これは2つの1時間のインキュベーションのステップ、と繰り返し洗浄し、遠心分離のステップのために時間を集中的にプロシージャを指定できます。に多くの時間を残すためにこのプロシージャの2つの全体の日を計画するのが最善です。 DNA濃度と洗浄の間に200 -500μLまで減らすためにアミコンチューブの最後の抽出量を得るに問題があ?…
Acknowledgements
我々は、沿岸と外洋水の低酸素領域で進行中の研究を支援するためのイノベーション、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金と国立科学およびカナダの工学研究審議会（NSERC）のためのカナダの財団に感謝の意を表します。 JJWはNSERCとDAWからの奨学金によって支えられてNSERC、キラムと微生物多様性と進化のための資金を供給センタートゥーラ基礎から奨学金によって支えられている。 SLは、微生物の多様性と進化のためのトゥーラ基礎資金センターによってサポートされていました。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD | 309597 | ||
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | ||
| 15ml tubes | Sigma | CLS430791 | ||
| 5cc syringe | BD | 309603 | ||
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit | |
| Butanol | Fisher | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) | |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter | 368690 | ||
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter | 369003 | ||
| Cesium chloride | Sigma | C4036 | ||
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma | 25666-500ML | ||
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma | E1510-10ml | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma | E5134 | ||
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C | |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | |||
| Lysozyme | Sigma | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE | |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | 50 bp cut off | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-10 | ||
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma | 77617-500ML | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| RNase A | Fisher | BP2539-100 | 10 μg/ml | |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L4509 | 20% SDS | |
| Sterivex filters | Fisher | SVG010RS | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| TE buffer, pH 8.0 | ||||
| Trizma® base | Sigma | T1503 | ||
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter | 343847 | ||
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman | 343775 | ||
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman | 348302 | ||
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter |
Referencias
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
