Lentivirus de producción

Summary

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Abstract

ARN de interferencia (ARNi) es un sistema de silenciamiento de genes en las células vivas. El ARN de interferencia, en la secuencia de genes homólogos a corto RNAs de interferencia (siRNA) son silenciadas en el estado post-transcripcional. ARN de horquilla corta, los precursores de siRNA, se puede expresar mediante lentivirus, lo que permite el ARNi en una variedad de tipos de células. Los lentivirus, como el virus de inmunodeficiencia humana, son capaces de infectar tanto a la división y que no se dividen las células. Vamos a describir un procedimiento que a los lentivirus paquete. Envase se refiere a la preparación de virus competentes de vectores de ADN. Lentiviral los sistemas de producción de vectores se basan en un 'split' del sistema, donde ha sido el genoma del virus natural de división en las construcciones de plásmido auxiliar individual. Esta división de los diferentes elementos virales en cuatro vectores separados disminuye el riesgo de crear un virus capaz de replicarse por recombinación accidental del genoma del lentivirus. Aquí, un vector que contiene la shRNA de interés y tres vectores de empaquetamiento (p-VSVG, PRSV, pMDL) son transfectadas transitoriamente en 293 células humanas. Después de al menos un período de incubación de 48 horas, el sobrenadante que contiene el virus se recoge y se concentra. Finalmente, título del virus se determina por el reportero (fluorescentes), expresión con un citómetro de flujo.

Protocol

Parte 1: La transfección de células HEK 293 células para producir lentivirus * 24 horas antes de la transfección, la placa de 2,5 X 10 6 células en una placa de 10 cm para una confluencia del 50-70% al día siguiente. Inicio este protocolo mediante la preparación de ADN con la que uno más tarde transfectar una de las células para hacer virus. En primer lugar, diluir FuGENE 6 Transfección reactivo Roche, un reactivo de los lípidos que componen las células toma…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS		Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG		Roche
Bleach		Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes		Falcon	353003
Multichannel pipette		Rainin
Filtered pipette tips		Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)		Eppendorf
Ultracentrifuge tubes		Beckman
Tissue culture incubator at 5% CO2		Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge		Beckman
Fluorescent microscope		Coulter
FACS Array		Beckman