Эта процедура описывает метод для изоляции и культуре мышиных орган Корти с или без спирального лимба и нейронов спирального ганглия. Мы также продемонстрировать метод для выражения экзогенного гена-репортера в органе Корти эксплантатов путем электропорации.
Во всех млекопитающих, сенсорного эпителия для прослушивания расположен вдоль спирали кортиева органа, который находится внутри раковины форме улитки внутреннего уха (рис. 1). Волосы клеток в развивающихся улитки, которые mechanosensory клеткам слуховой системы, выровнены в один ряд внутренних волосковых клеток и три (в базовых и средних оборотов) до четырех (в апикальной очередь) ряда внешних волосковых клеток , которые охватывают длина кортиева органа. Волосы клетки преобразовывать звук вызванных механические колебания базилярной мембраны в нервные импульсы, которые мозг может интерпретировать. Большинство случаев нейросенсорной потери слуха вызвано смерти или дисфункции кохлеарные волосковые клетки.
Все более важным инструментом в слуховом исследование изоляции и в лабораторных условиях культуру орган эксплантов 1,2,9. После выделения, эксплантов может быть использован несколькими способами, чтобы представить информацию о нормативной, аномальный, или терапевтических физиологии. Экспрессия генов, стереоцилий подвижность, клеточной и молекулярной биологии, а также биологических подходов для волос регенерации клеток являются примерами экспериментальных приложений органа эксплантов Корти.
Этот протокол описывает метод для изоляции и культуры орган Корти от новорожденных мышей. Сопровождающее видео включает ступенчатое направления для изоляции височной кости от мыши щенков, и последующей изоляции улитки, спиральной связки, и кортиева органа. После выделения, сенсорного эпителия могут быть покрыты и культивировали в пробирке в полном объеме, или, как еще расчлененный микро-изоляции, что не хватает спираль лимба и нейронов спирального ганглия. Используя этот метод, первичные эксплантаты может поддерживаться в течение 7-10 дней. В качестве примера полезности этой процедуры, орган Корти эксплантов будет электропорации с экзогенными DsRed гена-репортера. Этот метод обеспечивает улучшение по сравнению с другими опубликованными методами, поскольку она обеспечивает воспроизводимые, однозначным, и ступенчатого направления для изоляции, микродиссекции и первичной культуры кортиева органа.
Есть несколько деталей, которые имеют решающее значение для успеха этой процедуры. Чем короче время от временной изоляции кости орган Корти инкубации, тем больше вероятность того, что органы будут приложить к покровным и привести к жизнеспособной культуры орган. Поэтому, важно ограничить количество времени между рассечение и размещения органов в инкубаторе. Выбор антибиотика также имеет решающее значение, так как многие антибиотики аминогликозидов являются ототоксичных и приведет к гибели клеток волос. Хотя желательно отказаться от использования антибиотиков в целом, это оставляет открытой возможность для загрязнения. Поэтому мы предлагаем использовать в 10 мкг / мл ампициллина, как правило, чтобы преодолеть возможные проблемы загрязнения.
Наиболее проблемных аспектов этого, и другие процедуры первичной культуре кортиева органа, является тенденция органов плавать с пластинами во время инкубации. Хотя плавающей культур органа могут оставаться жизнеспособными в течение 5-7 дней, Есть недостатки культивирования плавающей органов. Например, плавающая орган культур часто раза на себя через 4-5 дней оказания микроскопии проблематично. Впоследствии, структурную целостность органа может стать угрозой, по сравнению с органами, которые были прикреплены к покровным. Мы обнаружили, что следующие методы способствовать тому, чтобы орган Корти не плавать в культуральной среде, но остается прикрепленной к покровным. Во-первых, слой стекла покровные в 1:01 polyornithine / ламинин дополнена с 20% FBS, как описано. Инкубации в течение ночи, предусмотренных в данный протокол минимальное время, которое пластина должна быть покрыта. В нашей лаборатории, мы часто пальто все пластины, которые мы должны в течение одной недели и держать их при температуре 4 ° С до того дня, перед использованием, когда мы переместить их в инкубатор для инкубирования в течение ночи. Во-вторых, после того, органы транспортируются на покрытие покровные, ориентироваться эксплантов, так что реснички волосковых клеток лицевой стороной вверх. Это направление будет способствовать присоединение базилярной мембраны культуры блюдо. В-третьих, удаление информации в течение хорошо, чтобы прикрепить к эксплантов покрытием блюдо. Это позволит обеспечить контакт между блюдо культуры и базальной мембраны и повысить способность эксплантов придерживаться стекла. Это также поможет в поддержании структурной целостности рядов волосковых клеток. И наконец, осторожно капать по 2 капли культуральной среде на поверхности органа Корти использовании 200 мкл пипетки емкость, а затем медленно заполнить хорошо капает оставшийся объем (от общего объема 130 мкл) на стороне покровного стекла. Важно, чтобы работать быстро, чтобы обеспечить крепление органа Корти, чтобы покровное покрытие. С начала вскрытия для инкубации эксплантов, он обычно занимает 10 минут практикуется оператора для завершения этого органа процедуры изоляции Корти.
В этом протоколе, мы также представляем метод микро-изоляции чувствительного эпителия из спирального лимба из кортиева органа. В этой процедуре, спираль лимба рассечен подальше от чувствительного эпителия использованием 28G ½ инсулина иглы, как рассечение инструментов. В результате микро-изоляции состоит из рядов волосковых клеток и их соответствующие поддерживающие клетки (рис. 3). Изолированных сенсорного эпителия могут быть культивировали, как описано в данном протоколе. Этот микро-изоляции процедура должна быть по сравнению с ферментативной разделения сенсорного эпителия от окружающей ткани 4. У млекопитающих, а также не-млекопитающих, таких как куры, термолизин переваривания изолированы вестибулярный результаты органов в изоляции сенсорного эпителия из подвала мезенхимальных клеток 4. В крысы улитки, термолизин пищеварения приводит к разделению больше эпителиальных хребет, хребет меньшей эпителиальные и сопутствующие сенсорного эпителия от базальной мембраны 5. Тем не менее, неясно, является ли кохлеарный сенсорного эпителия можете прикрепить к пластинками, покрытыми без сопровождающих мезенхимальных клеток. Хотя и механических микро-изоляции методом и методом ферментативного результате пищеварения разделения сенсорного эпителия из спирального лимба, преимущества микро-изолировать рассечение над пищеварения термолизин включают относительно короткий протокол, более дешевые реагенты, и, возможно, меньше стресса для эксплантов из-за ферментативной эффекты пищеварения. Кроме того, базальной мембраны, остается без изменений в этом подходе, который может усилить крепление чувствительного эпителия к культуре пластины. Недостатки этого метода относится необходимость развития навыков в этой деликатной рассечение и потенциальных механических повреждений чувствительного эпителия в результате микро-рассечение.
В качестве примера полезности этой процедуры, мы также представляем один из примеров использования органаКорти культур; электропорации экзогенных генов в эксплантов культуры. Электропорации процедуре, описанной выше, основана на предыдущих методов орган электропорации Корти. Примечательно, что Чжэн и Гао (2000) описывают электропорации изолированных органов крыс Корти, где эксплантов удерживаются на месте для электропорации по формованных паз агарозы, а затем высевают на коллаген покрытием 8-а LabTek слайда в бессывороточной среде 2. Преимущество их подхода является то, что органы ориентированы так, что верхние поверхности эксплантатов лицо катода, что теоретически должно привести к равномерному распределению электропорации клеток через эксплантов. В наших руках однако, метод, который мы описываем усовершенствовали эту процедуру, поскольку орган Корти остались прикреплены к покровным на протяжении всей процедуры таким образом уменьшая манипуляции эксплантов после электропорации. Кроме того, высокий процент органов Корти остались прикреплены к покровные использовании этого метода представлено. Наш метод взят из Jones и соавт. (2006), который использует добавление Fugene 6 реагентов для повышения эффективности экспрессии генов после электропорации. В Jones и соавт. (2006) протокол, органы электропорации, инкубировали в течение 5 минут с 100 мкл Fugene 6 трансфекции реагентом, а также покрытием 6. Наш метод отличается тем, использование 3:02 отношение Fugene 6 реагента плазмидной ДНК, который мы нашли эмпирически, чтобы обеспечить оптимальную трансгенной экспрессии с минимальной токсичностью орган. Мы не используем неразбавленном Fugene 6 реагента, который может привести к токсичности для культуры. Конфигурации электродов в нашем протоколе, а также Jones и соавт. (2006), приводит к первичной экспрессии генов в любом спираль лимба или сенсорного эпителия в зависимости от положения катода. Хотя Есть DsRed положительных клеток на стороне культуры далекого к катоду, существует более высокая концентрация трансгенных клеток ближе к катоду. Чтобы обеспечить полное выражение трансгена в обе стороны органа Корти эксплантов, ток может быть отменено для второй серии импульсов простым обращением ведет. Представлен протокол результатов в прочном выражение трансгенов всей органа Корти (рис. 5).
Авторы хотели бы поблагодарить Demêmes Даниэль и Дуглас Cotanche и за их усилия в обучении нами методов выделения из кортиева органа. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Измаила Стефанов-Wagner для инженерных electroporator электродов; Шерри Лин ей способствующих обложки к видео-анимация; и Мэтью Хана, Джейсон Микер, и Кендра Маршалл ( www.goodfightproductions.com ) для производства видео. Эта работа финансировалась за счет грантов (R03DC010065-Паркер; RO1DC007174-Edge; P30DC05209-MEEI каркас для Слушания исследований) от NIDCD.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Glass microscope coverslips | DYNALAB Corporation (Rochester, NY) | 2010 | 10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce | |
4 ringed cell culture dish | Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 627170 | Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings | |
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO) | P4957 | 0.01% Solution | |
Laminin | BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) | 354232 | made in mouse | |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 26140-095 | Qualified | |
Operating scissors | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | RS-6806 | Straight, sharp-blunt length 5″ | |
#11 Scalpel Blade | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 372611 | ||
#4 Dumoxel forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11241-30 | ||
#55 Dumostar fine forceps | Fine Science Tools (Foster City, CA) | 11295-51 | ||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 10564-011 | High Glucose | |
Horse Serum | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 2605088 | Heat Inactivated | |
Ampicillin Sodium Salt | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11593-027 | Irradiated | |
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe | Becton Dickenson (Franklin Lakes, NJ) | 329465 | U-100 28G½ | |
Fugene 6 Transfection Reagent | Roche (Mannheim, Germany) | 11-815-091-001 | ||
Polystyrene test tube | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 14-956-5A | ||
Laminar flow hood | The Baker Company (Stanford, ME) | Model SG603a | SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet |
|
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985 | ||
Reporter plasmid | Clontech (Mountain View, CA) | 632539 | pCMV DsRed-Express 2 | |
Electroporator | BioRad (Hercules, CA) | 165–2662 | BioRad Gene Pulser Xcell |