Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41
Summary
Mama é uma proteína Magnetosome único associado que foi mostrado para ser envolvido na ativação magnetosome. Aqui apresentamos o protocolo de purificação da Mama exclusão mutante (MamAΔ41) de<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Abstract
Bactérias magnetotáticas compreendem um grupo diverso de microorganismos aquáticos que são capazes de se orientar ao longo campos geomagnético. Este comportamento é acreditado para ajudar sua busca por ambientes adequados<em> (1)</em>. Esta capacidade é conferida pelo magnetosome, uma organela subcelulares que consiste de um conjunto linear de cadeia de lipídios vesículas cada um capaz de biomineralize e juntar um cristal ~ 50 nm de magnetita ou greigite. Um componente princípio da magnetosome que mostrou-se necessário para a formação de vesículas funcional é mamãe. Mama é uma proteína muito abundantes magnetosome-associados, que é um dos mais caracterizados magnetosome proteínas associadas<em> In vivo</em><em> (2-6)</em>. Este artigo incide sobre a purificação da Mama, que apesar de ser estudado<em> In vivo</em>, Sem detalhes claros funcionais ou estruturais têm sido identificados por ele. Bioinformática análise sugeriu que mamãe é uma repetição tetra-tricopeptide (TPR), contendo proteína. TPR é um motivo estrutural encontrada como parte ou como formação de uma grande dobra em uma ampla gama de proteínas, ela serve como um modelo para interações proteína-proteína e proteína-mediador de vários complexos<em> (7)</em>. TPRs estão envolvidos em muitas tarefas cruciais nos processos de célula eucariótica organela e muitos caminhos bacteriana<em> (8-14).</em> Para entender Mama, um TPR única contendo proteína, proteína altamente purificada é necessária como um primeiro passo. Neste artigo, apresentamos o protocolo de purificação para um estábulo Mama exclusão mutante (MamAΔ41) de<em> M. magneticum</em> AMB-1.
Protocol
Discussion
Purificação de proteínas é o passo principal em todas as proteínas estruturais ou estudos bioquímicos. Uma vez que cada proteína é o único com seu próprio comportamento, é preciso definir suas propriedades e modificar sua purificação de acordo. Proteína-alvo deve ser analisado como um primeiro passo para a purificação utilizando ferramentas de bioinformática. Eles são usados para calcular o objectivo ponto iso-elétrico, avaliar a sua necessidade de redução / oxidação ambiente e sua necessida…
Acknowledgements
Reconhecemos Dr. Amir Aharoni por seu apoio e Davidov Geula, Noam Grimberg e Chen Guttman para os seus conselhos e comentários.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French Press | Equipment | Thermo scientific | FA-078A | |
| Pressure cell | Equipment | Thermo scientific | FA-032 | |
| Ultra-centrifuge | Equipment | Sorvall | Discovery 90SE | |
| Rottor | Equipment | Beckman | Ti60 | |
| Ultra-centrifuge tubes; PC-Bottle+Cap Assay 26.3ml | Equipment | Beckman | BC-355618 | |
| 2.5cm diameter, Glass Econo-Column Chromatography Columns | Equipment | BioRad | 737-2521 | |
| Ni-NTA His Bind resin | Equipment | Novagen | M0063428 | |
| Spectrophotometer | Equipment | Amersham Biosiences | Ultraspec 2100 pro | |
| Quartz cuvette | Equipment | Hellma | 104-QS | |
| Fast Performance Liquid Chromatography- AKTA purifier 10 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 28-4062-64 | |
| Ion exchange column – MonoQ 4.6/100 PE | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 10025543 | |
| Size exclusion pre-packed column-HiLoad 26/60 Superdex 200 | Equipment | GE Healthcare Biosciences | 17-1071-01 | |
| Centricon – Vivaspin15 – 10,000 MWCO | Equipment | Sartorius Stedim Biotech GmbH | VS1501 | |
| Table centrifuge | Equipment | Thermo scientific | IEC CL30R | |
| MALDI-TOF | Equipment | Bruker Daltonics | Reflex IV | |
| Tris-HCl (hydrotymethyl) aminomethane | Reagent | BioLab | 20092391 | |
| Sodium Chloride | Reagent | FRUTROM | 235553470 | |
| Imidazole | Reagent | Alfa Aesar | 288-32-4 | |
| EDTA free protease inhibitors cocktail | Reagent | Sigma | P-8849 | |
| Dnase I (Deoxyribonuclease I) | Reagent | Sigma | DN-25 | |
| Bovine Thrombin | Reagent | Fisher BioReagents | BP25432 | |
| Glycine | Reagent | BioLab | 07132391 | |
| Soudim Dodecyl Sulfate (SDS) | Reagent | BioLab | 19822391 | |
| Beta-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M-3148 | |
| InstantBlue | Reagent | Expedeon | 1SB01L | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Reagent | Fermentas | SM0671 |
Referencias
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