の受精アフリカツメガエル卵母細胞ホストの転送方式を使用して
Summary
施肥のための手順<em>アフリカツメガエル卵母細胞</em>ホストの転送方法によって。
Abstract
初期の開発を脊椎動物に母性遺伝の分子の寄与を研究することは、しばしば時間と母性効果変異動物を生成するために必要な費用によって妨げられている。さらに、例えば、 アフリカツメガエルやゼブラフィッシュなどの生物の遺伝子機能を過剰発現または抑制する手法の多くは、十分にそのようなWntシグナル伝達などの重要な母体のシグナル伝達経路を標的に失敗する。 アフリカツメガエルでは、培養卵母細胞での遺伝子機能を操作し、その後それらを肥やすことはある程度までこれらの問題を改善することができます。卵母細胞は、手動で、ドナーの卵巣の組織からdefolliculated必要に応じて注射したり、文化の中で処理し、成熟を誘導するためにプロゲステロンによって刺激されています。それらはホストの卵管を通じて転と変更し、受精に必要なゼリーのコートを取得される、すると次に、卵母細胞は、排卵ホスト女性のカエルの体腔内に導入されています。結果として得られる胚は、その後、目的のステージに上げ、あらゆる実験的摂動の影響について分析することができる。このホストベースの転送方式は、初期の開発の基本的なメカニズムを暴くのに非常に有効であったと他の脊椎動物のモデル生物では利用できない実験的な幅広い可能性を可能にしました。
Protocol
Discussion
転送が成功するには、受精し、卵母細胞の> 50％（図3）の正常な切断になります。一般的に転送卵母細胞の間に30〜60パーセントは、神経胚の段階を過ぎても存続します。我々は通常、表現型を視覚化するだけでなく、分析のいくつかのタイプ（その場で、RT – PCR）のための十分な胚が得られる実験群あたり75から150卵母細胞を、転送する。実質的により多くの卵母細胞を注入すると、大幅に…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、原稿の重要な読書のためにヒューストンの研究室のメンバーに感謝したいと思います。研究は、DWHに与え国立衛生研究所（GM083999）によってサポートされています
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
Referencias
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