تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف
Summary
إجراء التسميد<em> البويضات القيطم</em> من جانب المضيف أسلوب النقل.
Abstract
دراسة مساهمة جزيئات الموروثة للأمهات لالفقاريات التنمية في وقت مبكر كثيرا ما يصطدم في الوقت والنفقات اللازمة لتوليد الحيوانات الأم وتأثير متحولة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من التقنيات لoverexpress أو تثبيط وظيفة الجينات في الكائنات الحية مثل الضفدع والزرد تفشل بما فيه الكفاية لاستهداف الحرجة الأمهات مسارات الإشارات ، مثل إشارات Wnt. في القيطم ، لا يمكن التلاعب في الجينات وظيفة المثقف والتسميد البويضات في وقت لاحق لهم تخفيف هذه المشاكل إلى حد ما. وdefolliculated يدويا من نسيج المبيض البويضات المانحة ، أو حقن العلاج في الثقافة كما هو مطلوب ، وحفزت ثم مع البروجسترون للحث على النضج. المقبل ، وقدم البويضات في تجويف الجسم لاستضافة الضفدع الإناث البيض ، وعندها سيكون من خلال قناة البيض انهم translocated المضيف والحصول على التعديلات والمعاطف هلام اللازمة للإخصاب. ويمكن عندئذ للأجنة الناتجة يتم رفعها إلى المرحلة المطلوبة وتحليلها عن آثار أي اضطرابات التجريبية. وقد كان هذا الأسلوب المضيف نقل فعالة للغاية في الكشف عن الآليات الأساسية للتنمية في وقت مبكر ، وتتيح مجموعة واسعة من الاحتمالات التجريبية غير متوفرة في أي كائن فقاري النموذج الآخر.
Protocol
Discussion
وهناك نتيجة ناجحة في نقل الإخصاب والانقسام الطبيعي 50 ٪> من البويضات (الشكل 3). وعموما بين 30-60 ٪ من البويضات نقل البقاء على قيد الحياة في المراحل الماضية neurula. نحن عادة 75-150 نقل البويضات في المجموعة التجريبية ، والتي سوف تسفر الأجنة ما يكفي لعدة أنواع من التحليل (في الموق…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن مثل كتاب شكر لأعضاء المختبر هيوستن لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم البحث من المعاهد الوطنية للصحة (GM083999) منحت لDWH
Materials
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | (Invitrogen 11415-064) |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | (Sigma A-9418-50g) |
| 1x Penicillin-Streptomycin | (Sigma P-0781) |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
| 1M NaCl |
| 20 mM KCl |
| 20 mM CaCl2 |
| 10 mM MgCl2 |
| 150 mM HEPES |
| adjust to pH 7.6-7.8 |
| Store at 4°C |
Anesthetic solution
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | (Sigma A-5040) |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |
| Dissolve in Amquel-treated water | |
| Make fresh weekly | |
Progesterone stocks
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol |
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution |
| Store at -20°C |
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
| Blue: 0.1% Nile Blue A | (Aldrich 121479-5G), |
| Red: 0.25% Neutral Red | (Sigma N-6634), |
| Brown: 1% Bismarck Brown | (Sigma B-2759), |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.
Referencias
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. . Experimental Embryology: Techniques and procedures. , (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a ‘dorsal signal’ in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J., Richter, J. D. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. , 341-354 (1998).
