Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression
Summary
Dit artikel illustreert de bloemen-dip methode van<em> Agrobacterium tumefaciens</em>-Gemedieerde transformatie van<em> Arabidopsis thaliana</em>. Door de introductie van een cel-cyclus gereguleerde promotor-reporter,<em> PTSO2:: β-glucuronidase (GUS)</em>, In<em> Arabidopsis</em>, We zien hoe een verslaggever GUS expressie in transgene zaailingen detecteert.
Abstract
De mogelijkheid om vreemde genen te introduceren in een organisme is de basis voor de moderne biologie en biotechnologie. In het model bloeiende plant<em> Arabidopsis thaliana</em>, De bloemen-dip transformatie methode<sup> 1-2</sup> Heeft vervangen alle voorgaande methoden vanwege zijn eenvoud, efficiëntie en lage kosten. In het bijzonder, scheuten van jonge bloeiende<em> Arabidopsis</em> Planten worden gedompeld in een oplossing van<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Uitvoering van specifieke plasmide constructen. Na het dompelen worden de planten weer een normale groei en zaaigoed, een klein percentage van die getransformeerd met het vreemde gen en kan worden geselecteerd voor medium met antibiotica. Deze bloemen-dip-methode aanzienlijk vergemakkelijkt<em> Arabidopsis</em> Onderzoek en in hoge mate bijgedragen aan ons begrip van de plant genfunctie. In deze studie hebben we gebruik maken van de bloemen-dip methode om een reportergen te transformeren,<em> Β-glucuronidase (GUS)</em>, Onder de controle van<em> TSO2</em> Promotor.<em> TSO2</em>, Dat codeert voor het ribonucleotidereductasesysteem (RNR) kleine subeenheid<sup> 3</sup>, Is een celcyclus gereguleerd gen dat essentieel is voor dNDP biosynthese in de S-fase van de celcyclus. Onderzoek van<em> GUS</em> Expressie in transgene<em> Arabidopsis</em> Zaailingen toont aan dat<em> TSO2</em> Wordt uitgedrukt in actief delende weefsels. De gerapporteerde experimentele methode en materialen kunnen gemakkelijk worden aangepast, niet alleen voor onderzoek, maar ook voor het onderwijs op de middelbare school en universiteit niveaus.
Protocol
Discussion
De efficiëntie van de transformatie wordt bepaald door veel verschillende factoren, die hierna worden besproken:
- De gezondheid van de planten en hun leeftijd zijn van primair belang. Ongeveer een maand oude planten produceren van tal van onvolwassen bloemen knoppen zijn ideaal. Knippen uit primaire scheuten naar secundair scheutvorming 3-4 dagen aan te moedigen voor de transformatie zal toenemen transformatie-efficiëntie. Oudere planten zullen aanleiding geven tot transformanten, maar tegen een lager tari…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Chunxin Wang voor de bouw van pTSO2:: GUS en voor de foto's in figuur 1, Detlef Weigel voor het delen van de GUS-waterdicht protocol, Paja Sijacic, en Courtney Hollender voor nuttige commentaar. Onderzoek in het laboratorium Z. L s wordt ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (IOB0616096 en MCB0744752). ZL wordt gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Maryland Agricultural Experiment Station.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 6-benzyladenine | Sigma | 852430 | ||
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | ||
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma | G1019 | ||
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark | |
| Micropore 3M Tape | Fisher | 19027761 |
Referencias
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
