الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين
Summary
لقد أصبح القياس الكمي للالشرائط المزدوج حبلا الحمض النووي باستخدام تشكيل γH2AX كعلامة الجزيئية أداة لا تقدر بثمن في مجال البيولوجيا الإشعاعية. نحن هنا لشرح استخدام للمقايسة التألق المناعي للالكمي للبؤر γH2AX بعد التعرض للإشعاع من الخلايا.
Abstract
الحمض النووي مزدوج الجديلة (DSBs) ، والتي يسببها إما عمليات الأيض الذاتية أو من مصادر خارجية ، هي واحدة من آفات الحمض النووي الأكثر حرجا بالنسبة لبقاء والحفاظ على سلامة الجينوم. استجابة مبكرة للتحريض DSBs هو البديل من الفسفرة H2A هيستون ، H2AX ، على بقايا سيرين 139 ، في غاية الحفظ عزر SQEY C – المحطة ، وتشكيل γH2AX<sup> 1</sup>. بعد تحريض DSBs ، هو فسفرته بسرعة H2AX من فسفاتيديل inosito – 3 – كيناز (PIKK) عائلة من البروتينات ، رنح توسع الشعيرات تحور (ATM) ، الوحيدات كيناز الحمض النووي من البروتين المحفز وأجهزة الصراف الآلي وRAD3 ذات الصلة (ATR)<sup> 2</sup>. عادة ، يتم تورط القاعدة سوى عدد قليل من أزواج (BP) في جهاز تسوية المنازعات ، ولكن ، هناك تضخيم إشارة هامة ، نظرا لأهمية التعديلات لونين في إشارة الحمض النووي من التلف والإصلاح. بوساطة من الفسفرة H2AX في الغالب عن طريق أجهزة الصراف الآلي تنتشر إلى المناطق المجاورة من لونين ، مما يؤثر على ما يقرب من 0.03 ٪ من مجموع H2AX الخلوية في DSB<sup> 2،3</sup>. هذا يتوافق مع ما يقرب من 2000 الفسفرة جزيئات H2AX الممتدة ~ 2 MBP المناطق المحيطة بها من لونين من موقع DSB والنتائج في تشكيل بؤر γH2AX المنفصلة التي يمكن تصور بسهولة وquantitated بواسطة المجهر المناعي<sup> 2</sup>. فقدان γH2AX في DSB يعكس إصلاح ، ومع ذلك ، هناك بعض الجدل حول ما يعرف إصلاح كاملة من DSBs ؛ وقد اقترح أن يعيد كل من جدائل الحمض النووي كافية ومع ذلك ، فقد أشير أيضا إلى أن إعادة instatement من الدولة الأصلي لونين من الضغط ضروري<sup> 4-8</sup>. وdisappearence من γH2AX ينطوي جزئيا على الأقل ، عن طريق نزع الفسفات phosphatases ، والفوسفاتيز 2A 4C الفوسفاتيز<sup> 5،6</sup>. كذلك ، فقد تورطت إزالة γH2AX التي تنطوي على توزيع التبادل هيستون مع H2A.Z<sup> 7،8</sup>. الأهم من ذلك ، أدى التحليل الكمي من بؤر γH2AX لطائفة واسعة من التطبيقات في مجال البحوث الطبية والنووية. هنا ، علينا أن نظهر الأسلوب الأكثر استخداما المناعي لتقييم الحمض النووي من التلف من خلال الكشف الأولي والكميات من بؤر γH2AX في الكيراتينية γ – المشع الإنسان ملتصقة<sup> 9</sup>.
Protocol
Discussion
بعد التعرض للإشعاع المؤين (γ السينية) ، γH2AX شكل بؤر بؤر الأرقام بسرعة والتوصل إلى الحد الأقصى ما بين 30-60 دقيقة 2. لذا ، لدينا الوقت ساعة 1 نقطة بعد التشعيع يعكس تشكيل الأولي DSB. لقد استخدمنا جرعة الاشعاع ذات الصلة سريريا من 2 غراي عن تجربتنا. ومع ذلك ، يمكن استخدام أس…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). ويدعم LM عن طريق البحث في ملبورن (جامعة ملبورن) والمنح الطبية التكميلية لجنة حقوق الطفل التصوير. وبدعم من جامعة موناش مايكرو التصوير (الدكاترة ستيفن كودي وكارمايكل Iśka) لا تقدر بثمن لهذا العمل.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | Media | Invitrogen | 17005042 | Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE). |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | Chamber Slides | Nunc Denmark | NUN154534 | |
| Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks. | |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen | T3605 | DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | Refractive index of 1.42 at 20°C. |
| Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
| Tissue Culture Dish (150x25mm) | Petridish | BD Falcon | 353025 | |
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |
Referencias
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , (2009).
