층별 한천 마운팅: 반전된 현미경으로 장기간 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

Abstract

출처: 우파디야 이 S., et.al. 전체 제브라피시 배아의 연장 된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 층형 장착 방법. J. 비스 익스펙. (2020).

이 문서는 장기 화상 진찰을 위한 살아있는 제브라피시 배아를 탑재하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 반전 현미경에 이미징을위한 일반 유리 바닥 현미경 요리를 사용하여 비용 효과적이고 수행하기 쉽습니다. 마운팅은 다른 농도에서 아가로즈층에서 수행됩니다.

Protocol

1. 배아 준비 짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 26.5 ° C에서 배양하십시오.참고: 이것은 배아가 화상 진찰의 시작에 대략 30 somite 단계에 있다는 것을 그래서 태아의 발달을 감속합니다. E3에서 0.016-0.020% 트리카인에서 배아를 마취합니다. 색소 침착을 억제하려면 200 μM의 농도에 PTU를 추가하십시오. ?…

Representative Results

그림 1 : 장착 방법에 대한 설명. (A) 35mm 접시의 유리 바닥에 의해 생성된 작은 우물에 제브라피쉬 배아를 넣습니다. (B) 아가로즈 층 1을 작은 우물에 추가하여 배아를 덮습니다. (C) 조심스럽게 작은 우물 위에 커버 유리를 배치합니다. (D) 35mm 접시의 전체 하단에 아가로즈 층 2를 추가합니다. (E) 요리에 E3를 추가합니다. (F) ?…

Materials

Low melting agarose	Sigma-Aldrich, MO	A9414	Store dissolved solution at 4 °C
35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom	MatTek Corporation, MA	P35GCOL-0-10-C
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich, MO	E10521	Store dissolved solution at 4 °C
N-phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich, MO	P7629	Store dissolved solution at -20 °C
DMC4500 digital microscope camera	Leica	NA
Micro cover glass 22×22 mm	VWR	48366 067