מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.
Abstract
דג הזברה הוא מודל החיה פופולרי למחקר על התפתחות העין בגלל המהירה שלה<em> לשעבר ברחם</em> פיתוח פוריות טובה. על ידי הפריה 3 ימים הודעה (DPF), הזחלים יראה את התגובה החזותית הראשונה. גנים רבים זוהו לשלוט על התפתחות העין הנכונה, אבל אנחנו רחוקים מהבנה מלאה של הארכיטקטורה הגנטית הבסיסית. הגנום כולו הגן פרופיל הביטוי הוא כלי שימושי להבהיר רשת רגולטורית גנטי להתפתחות העין. עם זאת, גודלו הקטן של העין עוברי דג הזברה עושה את זה מאתגר להשיג ברקמות העין שלם וטהור לניתוח הביטוי. לדוגמה, אורך קדמית, אחורית של העין בין יום 2 ו 3 רק כ 200-300 מיקרומטר, כאשר הקוטר של העדשה הוא 100 מיקרומטר פחות. כמו כן, אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) שבבסיס הרשתית היא רק אפיתל שכבה אחת. בעוד הביטוי פרופילים הגן ניתן לקבל העובר כולו, הם לא לייצג במדויק את הביטוי של רקמות אלה. לכן רקמות טהור יש לקבל עבור פרופיל ביטוי מוצלח של פיתוח הגן העין. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גישה microdissect הרשתית הרשתית שלם עם הרשתית מחוברים מן DPF 1-3, אשר מכסים שלבים עיקריים של המורפוגנזה העין. כל הנהלים ניתן לעשות עם מלקחיים בסדר וציוד מעבדה כללי לפי stereomicroscopes סטנדרטי. עבור לנתיחה הרשתית, הרשתית שכבה אחת היא להסיר קילף ידי צחצוח הפעולה ואת הדבקות מועדף של שרידי הרשתית אל פני השטח של הצלחת תרבות לנתיחה. עבור לנתיחה הרשתית המצורפת רשתית, הדבקות של הרשתית הצלחת הניתוח יוסר לפני לנתיחה, כך הרשתית ניתן לשמר לחלוטין עם הרשתית. פעולה הרמת זהיר של רקמה זו יכולה ביעילות להפריד את דמית העין sclera משוערת ו. העדשה ניתן להסיר בשני המקרים על ידי מחט טונגסטן חרוט כימית. בקיצור, הגישה שלנו יכול להשיג ברקמות העין שלמים נוצל בהצלחה כדי ללמוד ספציפיים רקמות ביטוי פרופילים של הרשתית דג הזברה<sup> 1, 2</sup> ו אפיתל הפיגמנט ברשתית<sup> 3</sup>.
Protocol
חלק 1: הכנות לפני microdissection פתרונות E3 בינוני 4 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2 ו – 0.33 mM MgSO 4). הפתרון של הצלצול 1, 5 (116 mM NaCl, KCl m…
Discussion
Microdissection של רקמות דג הזברה עין יכול למעשה לקבל הרשתיות שלם הרשתית המצורפת הרשתיות. זו מסייעת באופן משמעותי מחקרים ביטוי הנוגעים רקמת עין ספציפיים (כלומר הרשתית הרשתית או). למעשה, יש לנו מנוצל בהצלחה הליכים אלה להשיג פרופילים ביטוי RNA של הרשתית כולה 1 ו 3 הרש?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי קרן הזנק מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת Purdue.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Cordless pestle motor
VWR
47747-370
DC power supply
Lascar
PSU130
Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)
VWR
47747-366
These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox
World Precision Instruments
500341
Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox
Fine Science Tools
11252-00
Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm
BD Biosciences
351007
These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope
Olympus
SZX16
Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone
Fine Science Tools
29008-01
Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate
Tokai Hit
MATS-U55SZX2B
This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL
Invitrogen
15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter
World Precision Instruments
TGW1510
Wooden Applicator
Puritan
807
This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.