Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce
Summary
Este protocolo descreve uma abordagem adesivo baseados em fita simples para amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido por detecção rápida de células toda a<em> Salmonella</em> Usando fluorescência<em> In situ</em> Hybridization (FISH).
Abstract
Este protocolo descreve um método simples para adesiva-fita baseada em amostragem de tomate e outras superfícies de produtos frescos, seguido em fita-hibridização fluorescente de situ (FISH) para detecção independente de cultura rápida de Salmonella spp. Fitas de células carregadas também podem ser colocados face para baixo em ágar seletivo para fase sólida de enriquecimento antes da detecção. Alternativamente, enriquecimentos de baixo volume de líquido (miniculture superfície do líquido) pode ser realizada sobre a superfície da fita em caldo não seletivo, seguido por FISH e análise através de citometria de fluxo. Para começar, fita adesiva estéril é colocada em contato com produtos frescos, uma leve pressão é aplicada, ea fita é removida, fisicamente extrair os micróbios presentes sobre estas superfícies. Fitas adesivas são montados lado-a em lâminas de vidro para microscópio e as células da amostra são fixados com formalina a 10% (30 min) e desidratados, utilizando uma série de etanol classificados (50, 80 e 95%; 3 min cada concentração). Em seguida, células carregadas fitas estão manchadas com tampão contendo uma Salmonella-alvo cocktail sonda de DNA e hibridização por 15 – 30 min a 55 ° C, seguido de uma breve lavagem em uma solução de lavagem para remover sonda não ligada. Aderente, FISH marcado células são então contrastado com o DNA de corante 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e os resultados são visualizados através de microscopia de fluorescência. Para o enriquecimento de fase sólida, célula carregada fitas são colocadas de face para baixo sobre uma superfície adequada agar seletivo e incubado para permitir o crescimento in situ de microcolônias Salmonella, seguido por FISH e microscopia, como descrito acima. Para miniculture superfície do líquido, células carregadas fitas são colocadas lado adesivo para cima e uma câmara de perfusão silicone é aplicado de modo que a fita eo formulário microscópio deslize a parte inferior de uma câmara estanque em que um pequeno volume (mL ≤ 500) de Trypticase Soy caldo (TSB) é introduzido. As portas de entrada estão fechados e as câmaras são incubadas a 35-37 ° C, permitindo o crescimento baseado em amplificação de fita-extraídos micróbios. Após a incubação, portas de entrada são selados, as células são separadas e misturadas com volta vigorosa e para trás pipetagem, colhidas através de centrifugação e fixados em 10% neutro tamponado. Finalmente, as amostras são cruzados e analisados através de citometria de fluxo para revelar a presença de Salmonella spp. Como descrito aqui, o nosso "fita-FISH" abordagem pode fornecer amostragem simples e rápido e detecção de Salmonella em superfícies de tomate. Temos também utilizado esta abordagem para a amostragem de outros tipos de produtos frescos, incluindo espinafre e pimentas jalapeño.
Protocol
Discussion
Métodos simples e rápido para a detecção de patógenos em superfícies produzem podem ajudar a mitigar doenças transmitidas por alimentos, fornecendo dados em tempo útil e acionável. Adesiva métodos baseados em fita de amostragem têm sido usados em microbiologia ambiental, clínico e alimentar desde a década de 1950 e envolvem pressionando de "Scotch" fita-de estilo para superfícies para remoção de microorganismos, seguido por exame microscópico direto ou transferência de microrganismos ad…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento para este trabalho foi fornecida por um prêmio Grow Fundo Iowa Valores para BFBS.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
Referencias
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