접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한
Summary
이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을 설명합니다<em> 살모넬라균</em> 형광을 사용하여<em> 현장에서</em> 하이브리드화 (물고기).
Abstract
이 프로토콜은 살모넬라균 종의 급속한 문화 독립적인 감지를위한 현장 하이브리드화 (물고기)에서 테이프 형광 다음 토마토와 다른 신선한 농산물 표면의 접착 테이프 기반의 샘플링을위한 간단한 방법을 설명합니다. 셀 – 충전 테이프도 검색하기 전에 고체 상 농축을위한 선택적 한천에 얼굴을 아래로 둘 수 있습니다. 또는 낮은 볼륨 액체 enrichments (액체 표면 miniculture)는 유동세포계측법를 통해 물고기와 분석에 의해 다음이 아닌 선택 국물에있는 테이프의 표면에 수행할 수 있습니다. 시작하려면, 살균 접착 테이프는 신선한 농산물과 접촉을 가지고있다, 부드러운 압력이 적용되고 테이프는 실제로 이러한 표면에 존재하는 미생물을 추출, 제거됩니다. 테이프 유리 현미경 슬라이드에 쓰는 쪽까지를 탑재하고 샘플 세포는 포르말린 (30 분)과 탈수 10 % 등급 에탄올 시리즈 (50, 80, 및 95 %, 3 분 각 농도)를 이용하여 고정합니다. 다음 셀 충전 테이프는 살모넬라균 타겟 DNA 프로브 칵테일을 포함하는 버퍼 발견하고 15 hybridized 아르 – 55시 30 분 ° C, 언바운드 프로브를 제거하는 세척 버퍼 린스 간단한 다음. 자기편, 물고기 표시된 전지는 다음 형광 현미경을 사용하여 볼 수있는 DNA 염색 4 ', 6 diamidino – 2 – phenylindole (DAPI) 및 결과 counterstained 있습니다. 고체 상 농축 들어, 셀 충전 테이프는 적절한 선택 한천 표면에 얼굴을 아래로 배치하고 위에 설명된대로 피시 앤드 현미경 다음 살모넬라균의 microcolonies의 현장 성장에 수 incubated 수 있습니다. 액체 표면 miniculture 들어, 셀 충전 테이프 끈끈한 측면을 배치하고 실리콘 재관류 챔버 적용되도록 테이프 및 현미경 슬라이드 양식 물이 꽉 챔버로의 하단 Trypticase 콩의 작은 볼륨 (≤ 500 μL) 국물 (TSB)가 도입됩니다. 입구 포트는 봉인되고 회의소는 35 incubated 있습니다 – 37 ° C, 테이프 추출한 미생물의 성장 기반 확대를 수 있도록합니다. 부화 후, 입구 포트 unsealed 있으며, 세포 분리 및 혼합 활발한 뒤로와 앞으로 pipetting, 원심 분리를 통해 수확와 10 %에서 해결된 중성 포르말린 버퍼. 마지막으로 샘플은 hybridized과 살모넬라균 종의 존재를 나타내기 위해 유동세포계측법를 통해 심사하고 있습니다. 여기에 설명한 바와 같이, 우리의 "테이프 – 물고기"접근 방식은 토마토 표면에 간단하고 빠른 샘플링과 살모넬라균의 검출을 제공할 수 있습니다. 또한 시금치와 잘라페노 후추를 포함한 신선한 농산물의 다른 유형을 샘플링이 접근 방식을 사용하고 있습니다.
Protocol
Discussion
생산 표면에 병원균의 검출을위한 간단하고 빠른 방법은 시의 적절하고 실질적인 데이터를 제공함으로써 식인성 질환을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접착제 테이프 기반 샘플링 방법은 1950 년대 이후, 환경 임상 및 식품 미생물학에서 사용하고 직접 현미경 검사 또는 고체 미디어에 점착 성의 미생물의 양도 다음, 미생물의 제거를위한 표면에 '스카치'스타일 테이프를 눌러 포함되?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 대한 자금은 BFBS로 성장 아이오와 값 기금 보너스에 의해 제공되었다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
Referencias
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