快速PCR热循环利用微型热对流

Summary

我们描述了一种新的方法，通过聚合酶链反应（PCR）进行DNA复制。热对流是利用变性，退火，以及延长条件之间不断穿梭试剂保持反对在反应器的表面温度恒定。这在本质上简单设计的承诺，使快速PCR更方便。

Abstract

许多分子生物学实验取决于在一些聚合酶链反应（PCR）扩增最初稀的目标DNA样本检出浓度水平的方法。但常规的PCR热循环硬件的设计，主要是基于大量的金属加热块的温度是由热电热水器的监管，严重限制了可^达到的反应速度1。大量的电力，还需要反复加热和冷却的试剂混合，限制部署在一台便携式的格式这些文书的能力。

已经成为一个有前途的替代热循环的方法，有可能克服这些局限性^2-9的热对流。对流的流量每天都发生在一个多样化，包括从地球的大气层，海洋，内饰，装饰和丰富多彩的熔岩灯的设置的。流体运动开始以同样的方式，在每一种情况下：浮力驱动的不稳定发生时，密闭的液体量是受到空间的温度梯度。这些相同的现象提供一个有吸引力的的方式进行PCR热循环。应用跨一个适当设计的反应器几何的静态温度梯度，连续的循环流动，可以建立，将通过反复运输的变性，退火，和扩展阶段的反应（图1）温区的PCR试剂。在伪等温方式，热循环，因此可以被驱动，只需在固定温度下两种对立的表面，完全消除需要反复加热和冷却仪器。

对流热循环设计所面临的主要挑战之一是需要精确控制反应器内的空间的速度和温度分布，以确保试剂的顺序占据足够^的时间10,11期的正确的温度区。在这里，我们描述了我们努力探索的全三维速度和温度分布在微尺度对流^热循环12的结果。出乎意料的是，我们已经发现了复杂的流动轨迹进行PCR极为有利的，因为一个协同组合（1）流动路径之间的不断交流提供了一个增强的机会，试剂，样品的最佳温度廓线的全方位的一个子集，（ 2）增加花费的时间内延伸温度区的速率限制PCR步骤。极其迅速的DNA扩增时间（10分钟）在反应堆设计产生这些流动实现的。

Protocol

1。对流热循环的基本设计我们已经构建了一个简单的对流热循环设备可互换的塑料反应室“墨盒”是两个铝板的温度可以独立控制（图2）之间夹着组成。 圆柱反应堆井嵌入式加工聚碳酸酯块阵列孔与孔的直径和塑料板的厚度，以达到所需的高宽比（高度/直径= H / D）的不同组合。在这里提出的结果被认为是两种不同的反应器几何：H / D = 9：H = 15.9毫米，D = 1.75毫米，38.2μL量; H / D = 3：H = 6.02毫米，D = 1.98毫米，18.5微升音量。 该反应器的底部表面被加热使用铝块，其中包含墨盒加热器与microprocesser驱动温度控制器接口。 在反应器的上表面的温度调节使用铝块连接到一个循环水浴。 整个大会钳制在一起使用尼龙螺丝限制反对的铝块之间的热传导。 2。 PCR反应的制备和载入一个典型的100μL反应混合物中含有MgCl 2的 10μL10X缓冲液中，25毫米6μL，10μL，dNTPs（各2毫米），41.2μL去离子水，10μLβ-肌动蛋白探针，10μLβ肌动蛋白正向引物，10μLβ-肌动蛋白的反向引物，2μL的人类基因组DNA模板（10毫微克/μL）和KOD ​​DNA聚合酶（2.5个/μL）0.8μL。 在装载试剂，密封的PCR室底部的表面，使用铝带的薄板。 与10毫克/毫升的水，牛血清白蛋白有雨- X的防雾的解决方案冲洗反应堆井。 进入反应堆井用长胶装枪头移液器试剂和铁氟龙胶带密封上表面。 3。运行中的对流热循环反应在开始反应，预热铝块所需的上部和下部的表面温度。 夹心塑料反应堆装有铝加热块之间的PCR试剂，并迅速用尼龙螺丝钳大会。 所需的时间进行反应后，关掉加热器和地方的低（热）设备表面冷冻的金属块，迅速冷却，并停止对流顶部。 取下塑料反应堆和吸管井（用长胶加载提示）的产品，以供后续分析。 4。执行凝胶电泳分析准备2％琼脂糖凝胶加热一种震撼人心的热点板块1X缓冲液500毫升10克的琼脂糖，直到解决方案变得清晰。 装入托盘铸造的琼脂糖凝胶电泳，插入梳子。让凝胶集，约30分钟。 取出梳子和1X TAE缓冲液中添加，直到被淹没凝胶。 荧光染色的DNA样本包含2μL，100X SYBR GREEN我的解决方案，2μL的DNA样本，2μL6X橙色样染料，和4μLTAE缓冲液。 添加入井的DNA样本，并运行在60 V与100 bp的DNA梯状条带大小的标记1小时的分离。 取出凝胶和照片，在紫外光下获得的结果。 5。代表性的成果： 对流热循环的优化设计，包括选择正确的反应器的几何形状，会产生一个循环流动，能够通过在PCR过程中所涉及的主要温度运送试剂。可以在这里考虑的圆柱形反应堆不同的几何参数的高度（H）和直径（d），或等价的高宽比（H / D） 。我们已经探索的3 – D流领域，通过一系列不同的方面使用计算流体力学（CFD）的比率PCR反应器内对流和发现可能会出现意外复杂的图案。更重要的是，我们的分析发现这些复杂的流场，大大加快反应 12的一个子集。 反应堆比较高，低长宽比的流场，可以清楚地看到这些几何效应。在高纵横比的情况下（H / D = 9;一个高个子，瘦的缸），是平流输送流体元素沿轨迹跟踪，基本上都是封闭的循环路径，他们锁定的长期遵循相同的路径（图3a）。因此，有交流的机会很少，在F，暴露试剂的PCR扩增的退火和变性反应器的顶部和底部表面极端之间振荡，并在余下的轨迹更大的合奏，做不作出贡献，以扩增（本地化更接近中心热条件最优序列低轨迹反应堆）。 在一个较小的长宽比（H / D = 3;更短，更广泛的缸）的流场有很大不同，变得更加混乱的意识，流体元素轨迹不能再走封闭路径（图3b）。因此，即使试剂受到更复杂的温度曲线，流体元素能够探索出一条轨迹的范围更广，使更多的试剂量有机会体验到最佳的温度曲线。这些结果直觉相反建议，个别流动轨迹，而在H / D = 9，可能会出现产生的温度曲线进行PCR更为有利的，类似于在一个传统的热循环，混沌性质的流场，在 H /就业的“看“ D = 3，最终在全球范围内占主导地位，促进加强交流，使试剂不会成为被困在不利的轨迹很长。 为了检验这一假设，并确定这更有利于进行PCR反应器几何，我们用他们两个执行一个295 bp的目标从人类基因组DNA为模板的β-肌动蛋白基因PCR复制。值得注意的是，我们经常达到正确的目标产品的放大，在只有10分钟在H / D = 3（图4a），而同样的反应，检测的产品之前，需要至少20 分钟，在 H / D = 9（图4b） 。反应的特异性也远在 H / D = 3获得一个单一的PCR产物，而多个非特异性产物生成在 H / D = 9，流场的陷阱流体元素在长时间的不利的热轨迹。 图1：在一个圆柱形腔的顶部和底部表面的热对流，保持固定在不同温度。如果在底部表面温度高于顶部，垂直密度梯度是建立在封闭液是能够产生一个循环流动模式。对流的流场的几何参数（ 高度 H和直径 d）正确的选择，可以利用驱动PCR热循环时，顶部和底部表面附近退火和变性温度分别为（重力作用垂直向下）manintained 。 图2（A）一个对流的关键组成部分PCR扩增thermocyler。反应堆盒由聚碳酸酯块包含一个圆柱商会阵列。夹块之间要连接到一个循环水浴和底板结合嵌入式加热器设计一个顶板。 （二）PCR试 ​​剂加载和反应器内墨盒密封，组装后的设备进行反应。工程完成后，可以很容易吸管procucts供后续分析。 图3。计算机模拟的3 – D对流领域圆柱形反应堆内产生的温度在53和96 ° C的顶部和底部表面施加，分别。结果显示长宽比（ 一 ）H / D = 9（38.2μL的反应器体积）和（B）H / D = 3（18.5μL的反应器体积）。由流体的三维流场的元素是一个代表性的轨迹显示在左沿路径的顶视图和侧视图预测是在合适的温度随时间变化的流体元素相应的情节。在H / D = 9的温度曲线出现接近传统的热循环，但在H / D = 3的乱流场是直觉相反PCR更为有利。 图4。DNA复制反应器的几何结构显示在图3（上下表面均保持在53和96℃，分别）获得的结果。 （ 一 ）PCR是大大加快了H / D = 3，明显可见的强大的产品后的反应时间只有10分钟（M：100 bp的阶梯，车道1-4：产品在4个不同的圆柱腔平行反应）。 （二</strONG>）在H / D = 9，执行相同的反应需要至少20分钟前有形产品，和多个频段所需的产品除了在明显表明非特异性的靶DNA的复制（M：100 bp的阶梯，泳道1-2：在2个不同的圆柱腔的平行反应的产品）。

Discussion

混乱平流的影响下，流动和化学反应之间的相互作用发生显着变化。但这些复杂的流动状态是具有挑战性的研究，特别是在逼真的3D效果成为重要的几何形状。瑞利 – 贝纳尔对流在H / D> 1，不仅提供了一个方便的平台，探索这些现象，他们的应用程序进行PCR，也使被探测的流动和化学反应之间的耦合。这种独特的能力使我们能够选择最佳的流动状态混乱影响行为（直觉相反），以加速DNA的复制率。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
KOD DNA Polymerase kit		Novagen	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit		Applied Biosystems	401846
Aluminum tape		Axygen, Inc.	PCR-AS-200
Bovine serum albumin		Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog		SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips		Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape		McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel		Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer		Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I		Invitrogen/Molecular Probes	S7563
6x Orange Loading Dye		Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker		Bio-Rad	170-8202