여기, 우리는 효율적인 cryopreservation을위한 방법을 설명하고 매우 풍부한 문화의 연결을 생성하는 대뇌 피질의 뇌 조직 블록의 해동. 이 간단한 프로토콜은의 연결을 astrocyte와의 연결을 전구체 세포 배양 이후 세대 유연성을 제공합니다.
본 연구에서는, 우리는 성공적으로 cryopreservation과 매우 풍부한 문화의 연결을 생성하는 대뇌 피질의 뇌 조직 블록의 해동을위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에 사용되는 냉동 매체는 행크의 버퍼 소금 솔루션 (HBSS)에 희석 10% 디메틸 sulfoxide (DMSO)입니다. 대뇌 피질의 조직 단위는 냉동 매체를 포함하는 cryovials로 전송 천천히 -1 속도 제어 냉동 컨테이너 ° C / 분 냉동 있습니다. 포스트 해동 처리와 지속적으로 10 일 이내에 문화의 연결 네트워크의 중요한 확장에 처음 5 일 동안 급속한 성장을 neuritic 전시의 연결 – 풍부한 문화를 생산 냉동 조직 블록의 해리. astrocytic 마커 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)과의 연결 마커 베타 tubulin 클래스 III와 Immunocytochemical 얼룩은 문화의 뉴런과 astrocytes 높은 숫자를 공개했다. 조직 블록 분리 후 신경 전구체 세포 문화의 생성은 급속도로 차별 조건 뉴런과 astrocytes 다수의 생산 neurospheres을 확장 결과. 이 간단한 cryopreservation 프로토콜은의 연결을 astrocyte와의 연결을 전구체 세포 배양 이후 세대 증가 유연성을 부여 피질 뇌 조직 블록의 급속한, 효율적인, 그리고 저렴한 보존에 대한 수 있습니다.
Cryopreservation는 나중에 사용하기 위해 은행 소중한 뇌 조직 샘플 수있는 기회를 제공하고 있습니다. 우리가 신경 세포 – 풍부한 문화와 냉동 뇌 조직의 연결 블록에서 전구체 세포 모두를 생성하는 간단하지만 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 이것은 경제적인 절차는 더 비싼 요금 제어 냉동고를 활용하여 전통적인 cryopreservation 기술의 비용을 방지합니다. 프로토콜은 조직 블록을 동결하는 빠른 아직 효과적인 수단을 제공함으로써 해동 후 가능한의 연결을 문화의 생성을 허용합니다. 전체 냉동 과정은 약간 20 분 정도 걸릴 수 있습니다. 기본의 연결을 문화뿐만 아니라,이 방법을 조직 블록을 사용하는 것은 또한 부유 neurospheres로 성장 NPCs를 생성하기 위해 해동 수 있습니다. 이 점에서 우리 동결 매체 혈청의 부족은 세포가 undifferentiated 상태로 유지되는지 확인합니다. 차별 조건에서 neurospheres는 냉동 조직 쇼 확장과 새로운 조직에서 생성된 neurospheres 매우 비교 차별화 속도에서 생산.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 UCI (AR 및 SP)에서 학부 연구 기회 프로그램에서 보조금 캘리포니아 알츠하이머 질병 이니셔티브없이 건강 부여의 국립 연구소의 국가에서 보조금에 의해 지원되었다. HD38466, 그리고 알츠하이머 병 연구 센터는 부여하지 않습니다. AG16573 (JB)
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X | |
Bovine calf serum supplemented | HYCLONE | SH30072.03 | For culture medium | |
Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | ||
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium | |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium | |
Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation | |
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4527-30KU | Tissue dissociation | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium | |
Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells | |
antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination | |
Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fischer Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells | |
Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific | 1111-2721 | ||
21 G1 precision guide needles | Beckton Dickinson | 305165 | To clean tissue | |
10 ml pipette | USA Scientific | 1071-0810 | Individually wrapped | |
50 ml tubes | USA Scientific | 926-9-04 | ||
Single edge razor blade | Smith Brand | 67-0238 | To chop tissue | |
60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | For general culture | |
100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0010 | For cleaning tissue | |
Cryogenic box | NALGENE Labware | 5026-1010 | ||
Freezing container | NALGENE Labware | 5100-0001 | “Mr. Frosty” | |
2.0 ml cryogenic vials | NALGENE Labware | 5012-0020 | ||
DMSO | Fischer Scientific | D128-500 | For freezing medium | |
Ethanol 200 proof | Sigma | E7023 | For sterilizing razor blade |