Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d'embryon de souris

Summary

Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour l'isolement et la culture de la niche de cellules progénitrices du rein d'embryon de souris qui peuvent être utilisées pour étudier les voies de signalisation réglementant cellules souches / progénitrices du rein en développement. Ces cellules cultivées sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui permet une manipulation efficace des voies candidat.

Abstract

Le développement embryonnaire du rein a été largement étudié à la fois comme un modèle pour l'interaction épithélio-mésenchymateuse dans l'organogénèse et d'acquérir la compréhension des origines de la maladie rénale congénitale. Plus récemment, la possibilité de piloter naïve cellules souches embryonnaires vers des destins néphrogénique a été explorée dans le domaine émergent de la médecine régénérative. Des études génétiques chez la souris ont identifié plusieurs voies nécessaires pour le développement du rein, et un catalogue global de la transcription du gène dans l'organe a été récemment générées http://www.gudmap.org/ , offrant de nombreux régulateurs candidat des fonctions essentielles de développement. L'organogenèse du rein chez les rongeurs peuvent être étudiés en culture d'organe, et de nombreux rapports ont utilisé cette approche pour analyser les résultats des deux protéines appliquant candidat ou faire tomber l'expression de gènes candidats en utilisant siRNA ou morpholinos. Cependant, l'applicabilité de la culture d'organes pour l'étude de la signalisation qui régule la tige / différenciation de cellules progénitrices de renouvellement par rapport au niveau du rein en développement est limité en tant qu'organes de culture contenant une diffusion matrice compacte limitant extracellulaire des macromolécules et des particules virales. Pour étudier la signalisation cellulaire des événements qui influencent la tige / niche de cellules progénitrices dans les reins, nous avons développé un système de cellules primaires qui établit la zone néphrogénique ou une niche de cellules progénitrices de l'ex vivo du rein en développement dans l'isolement de l'inducteur de la différenciation épithéliale. En utilisant la digestion enzymatique limitée, les cellules de zone néphrogénique peut être sélectivement libérée de développer reins à E17.5. Après filtration, ces cellules peuvent être cultivées comme une monocouche irrégulière en utilisant des conditions optimisées. L'analyse du gène marqueur démontre que ces cultures contiennent une distribution des types cellulaires caractéristiques de la zone néphrogénique in vivo, et qu'ils maintiennent l'expression du gène marqueur approprié pendant la période de culture. Ces cellules sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui facilite grandement l'étude de la candidate souches / progéniteurs effets régulateur de la cellule. Paramètres biologiques de base cellulaires comme la prolifération et mort cellulaire ainsi que des changements dans l'expression des marqueurs moléculaires caractéristiques de néphrons cellules souches / progénitrices in vivo peuvent être utilisés avec succès comme les résultats expérimentaux. Les travaux en cours dans notre laboratoire en utilisant cette technique de cellules primaires roman vise à découvrir les mécanismes de base régissant la réglementation de l'auto-renouvellement versus différenciation dans les néphrons cellules souches / progénitrices.

Protocol

1. La préparation de réactifs pour la digestion rein 1,5 ml de collagénase 0,25% A (p / v) et 1% Pancréatine digérer (w / v) sera nécessaire pour l'extraction des cellules de zone néphrogénique (NZCS) à partir de 8 E17.5 reins. Parce Pancréatine dure environ 2 heures pour dissoudre à la température ambiante, assez condensé solution pour le plus grand nombre de reins embryonnaires attendus doivent être réalisés avant l'expérience. Préparer digérer solution en ajoutant d'abord 25 …

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler et cultiver les cellules de la zone néphrogénique du rein embryonnaire. Il est le développement d'une méthode initialement publié dans le cadre d'une étude sur les effets des traitements sur les cellules BMP7 de la zone néphrogénique (Blank et al., 2009). Dans l'étude initiale, une série d'expériences visant à caractériser les types de cellules représentées au sein de la population NZC ont été menées. Brièvement, la p…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Watchmaker’s forceps #5		Roboz	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A		Roche	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin		Sigma	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg		Lonza	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)		BioWhittaker	14-901E
HBSS		Gibco	14175
KSFM		Gibco	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM		Sigma	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml		Sigma	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin		BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate		Thermo Scientific	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca		Lonza	17-512F
5mL polystyrene tubes		BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)		Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer		BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde		Sigma	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100		VWR	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS		Sigma	P3813	Supplied as powder
Donkey serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2		Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal		MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin		Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568		Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI		Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield		Vector Laboratories	H-1000
Glycerol		EMD	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit		Qiagen	74004	Use “DNase on column” protocol
Transfer pipettes, 3ml		BD Falcon	357575