FISH für Präimplantations-Diagnostik

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

Abstract

Pre-Präimplantationsdiagnostik (PID) ist eine etablierte Alternative zu den pränatalen Diagnostik, und beinhaltet die Auswahl vor der Implantation Embryonen aus einer Kohorte von assistierten Reproduktion (ART) generiert. Diese Auswahl kann aufgrund der familiären monogenen Erkrankungen (zB Mukoviszidose) erforderlich sein, oder weil ein Partner trägt ein Chromosom Umlagerung (zB ein Zwei-Wege-reziproken Translokation). Die PID ist für Paare, die bisherigen betroffenen Kinder gehabt haben, und / oder im Falle von Chromosomenveränderungen, wiederholte Fehlgeburten oder Unfruchtbarkeit zur Verfügung. Eizellen abgesaugt folgenden Stimulation der Eierstöcke durch in vitro Eintauchen in Samen (IVF) oder durch intrazytoplasmatische Injektion eines einzelnen Spermiums (ICSI) befruchtet werden. Pre-Implantation Spaltung-Embryonen sind biopsiert, in der Regel durch die Entnahme einer einzelnen Zelle an Tag 3 nach der Befruchtung, und die Biopsie Zelle wird getestet, um den genetischen Status des Embryos zu etablieren. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) auf der festen Kerne biopsiert Zellen mit target-spezifischen DNA-Sonden ist die Technik der Wahl auf Chromosom Ungleichgewicht mit Chromosomenumlagerungen assoziiert zu erkennen und weiblichen Embryonen in Familien wählen mit X-linked Krankheit, für die es keine Mutation-spezifischen Test. FISH wurde auch auf dem Bildschirm Embryonen für spontane Chromosom Aneuploidie (auch als PGS oder PGD-AS genannt) verwendet worden, um zu versuchen und verbessern die Effizienz der assistierten Reproduktion, aber die beschriebenen prädiktiven Wert dieses Tests unter Verwendung der Streu-und FISH-Technik hier ist wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen die Hände und es ist nicht für die routinemäßige klinische Anwendung empfohlen. Wir beschreiben die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf die PID in einem klinischen Umfeld.

Protocol

1. Lysing und Verbreitung eines Ablegers aus einer Biopsie Blastomere Zell-Lyse-Puffer für die Verbreitung von Zellen (0,2% Tween20 in 0,01 M HCl, pH 2,0) sollten 24 Stunden im Voraus vorbereitet werden und bei -20 ° C. Bereiten Sie 100 mL und Filter 20 mL in ein 30 mL sterile Universal-Container mit einer sterilen 20 ml Spritze und die Spritze zu filtern. Dispense 1 mL Aliquots in 10 bis 15 1,7 ml sterile Reaktionsgefäße, in der Nähe und beschriften Sie die Rohre vor dem Einfrieren. Es wird empfohlen, zwei unterschiedliche Chargen verwenden, die neue Charge und die vorherige Partie, die getestet wurde und kann verwendet werden, wenn die neue Charge ist unbefriedigend sind. Defrost die Lyse-Puffer bei Raumtemperatur 30 Minuten vor der Biopsie. Aus praktischen Gründen die Betriebstemperatur wird zwischen Raumtemperatur und Temperatur der Hand sein. Ergebnis einen kleinen Kreis (ca. 5 mm Durchmesser) an der Unterseite eines Amin-beschichtete Folie (zB Genetix) mit einem Diamant-Stift und pre-Label die Folie mit dem Fall-Nummer, einzigartige Bild-Nummer, und Biopsie date. Verwenden Sie eine separate Folie für jeden Blastomere in numerischer Reihenfolge und Etikett mit der Embryo-Nummer. Folien sollten mit einem harten Bleistift wie 4H gekennzeichnet werden, und "ausgelöscht" mit einem Latex-Handschuh auf jeden Graphit Staub zu entfernen. Legen Sie ein kleines Volumen Lysepuffer innerhalb des Kreises. Übertragen Sie die biopsiert Blastomere in den Lysepuffer. Falls notwendig, Lysepuffer im Kreis, bis die Zelle beginnt zu lysieren; die Zelle vollständig zu lysieren und das Zytoplasma, bevor der Puffer trocknet zerstreuen. Beobachten Sie den Kern, um sicherzustellen, dass es innerhalb des Kreises bleibt und nicht verloren, wenn die Zelle nicht über einen Kern oder mehrere Kerne, Biopsie eine andere Zelle. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen bei Raumtemperatur. 2. In-situ-Hybridisierung eines einheitlichen Blastomere Nucleus Bereiten Sie eine Ethanol-Reihe (70, 90 und 100%) in sterilem destilliertem Wasser hergestellt. Schalten Sie ein und stellen Sie den heißen Block (zB Hybaid Omnislide oder Vysis Hybrite) bis 75 ° C. Defrost-Sonden, Wirbel, und Zentrifuge. Die Reagenzien sollten Zeugen und verifiziert werden, um vor denen sich die Sonde Gemisch zu korrigieren. Pipettenvolumina wie vom Hersteller zu machen bis die Sonde Gemisch in einer 0,65 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und vortexen, zentrifugieren vor Gebrauch angegeben. Das Gesamtvolumen der Sonde Mischung sollte ausreichend sein, damit 2 ul pro Kern getestet und bis auf die nächsten 10 ul einer Sicherheitsmarge ermöglichen abgerundet. Vorwäsche die Folien in Färbetrog mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) für 5 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Folien zweimal in sterilem destilliertem Wasser. Entwässern die Folien mit den Ethanol-Reihe (70, 90 und 100%) für 2 min bei Raumtemperatur und an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, Folien sind vollständig eingetaucht und wenn Grafitstaub schwimmt an der Oberfläche, genießen Sie mit einem sauberen Tuch. Notieren Sie die Position des Kerns innerhalb des Kreises durch die Visualisierung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Entwässern mit 100% Ethanol für 2 min bei Raumtemperatur und an der Luft trocknen. Apply 2 ul der Sonde Mischung, und mit einem 9 x 9 mm Deckglas (ein Viertel eines 18 x 18 mm no.1 Deckglas). Seal die Ränder des Deckglases mit Rubber Cement (zB Kuh-Gum, Cow Proofing). Codenature die Folien auf einem heißen Block bei 75 ° C für 5 min und dann hybridisieren die Objektträger über Nacht (16-20 h) in einer feuchten Kammer bei 37 ° C. Probe vermischt, die vollständig aus Zentromer-Sonden (dh für sex-linked Fälle) geben ein zufrieden stellendes Ergebnis nach 60 min der Hybridisierung. Bereiten Sie ein Wasserbad mit ausreichender Färbetrog und Hitze bis 71 ° C. Bereiten Sie eine 0,4-fach Standard-Salz-Citrat (SSC) strengen Waschlösung (pH 7,0 bei 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) und Wärme in das Wasserbad. Geben Sie 50 ml strengen waschen pro Coplin jar erforderlich und überprüfen Sie, dass die Temperatur 71 ist ° C unmittelbar vor dem Gebrauch mit einem sauberen Thermometer. Entfernen Sie vorsichtig das Gummi-Zement aus jeder Folie und spülen Sie das Deckglas mit 4x SSC/0.05% Tween20 (pH 7,0) bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Folien in der 0.4x SSC strengen Waschen bei 71 ° C für 5 min. Wash nicht mehr als 6 Folien pro Coplin Glas. Waschen Sie die Slides in 4x SSC/0.05% Tween20 bei Raumtemperatur für 2 min. Wenn die Sonde Mix enthält indirekt markierten Sonde (n), lassen Sie das Rutschen von überschüssiger Flüssigkeit und anwenden 20 uL fluoreszent konjugierten Antikörper unter einer 20 x 20 mm Quadrat Parafilm. Inkubieren in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 15 min. Entfernen Sie den Parafilm und waschen einmal in 4x SSC/0.05% Tween20 bei Raumtemperatur für 2 min. Zweimal waschen für 2 min in PBS eint Raumtemperatur und entleeren Sie die Dias. Bewerben 6 &mgr; l DAPI / Vectashield (160 ng von 4 ',6-Diamino-2-phenylindole dihydrochlorid in 1 ml Vectashield Eindeckmedium, Vector Laboratories) zu einem 22 x 22 mm nicht. 0 Deckglas und invertieren die Folie über dem Deckglas. Blot und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack. 3. Analyse mit einem Fluoreszenzmikroskop in geeigneter Weise mit entsprechenden Filtern für die verwendeten Sonden ausgestattet. Ergebnis Signale durch direkte Visualisierung mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops und Single-Band-Pass-Filter für jeden Fluorochrom in den Test. Jeder Kern soll durch zwei Analysten gewertet. Eine allgemeine Richtlinie sollte Scoring von einem einzigen Signal, wo zwei eng beieinander liegenden Signale sind weniger als ein Domain-(Signal-width) auseinander führen, allerdings benötigt Urteil auf Erfahrung ausgeübt, um Signale von unterschiedlicher Größe, Intensität und Trennung zu interpretieren. Verwenden Sie Imaging-Software (z. B. Isis, MetaSystems, Altlußheim, Deutschland; CytoVision, Genetix) ein Bild des Kerns zur Bestätigung der visuellen Diagnostik zu erfassen, und für die Bildarchivierung als Teil eines Labors zur Qualitätssicherung zu planen. 4. Repräsentative Ergebnisse: Metaphase und Interphase-Kernen aus kultivierten Lymphozyten des peripheren Blutes zu prüfen, um zu bestätigen, dass die ausgewählten Sonden, die spezifisch für die Translokation Chromosomen, informativ für die Haltepunkte (die subtelomere Sonden sollten nur hybridisieren, die umgesiedelt Segmente und die Zentromer-Sonde (n) an die zentrische werden Segment (s)) und die Signale in Interphasekernen sollte hell und diskret. Scoring der Anzahl der Signale pro Sonde in 100 Interphasekernen von jedem Partner wird empfohlen, um die Effizienz des Tests zu beurteilen. In diesem Fall 2-Signale wurden in 95% -99% der Kerne für jede Sonde erzielt. Abbildung 1 zeigt eine Metaphase und Interphasekern aus einer Vorbereitung für eine reziproke Translokation zwischen dem kurzen Arm von Chromosom 5 und 9. Signale in Interphasekernen vom Embryo Blastomeren sollte hell und diskrete und erzielte mit separaten Bandpassfilter für die verwendeten Farben. Abbildung 2 zeigt eine Blastomere Kern mit einem normalen Signal-Muster (2 Kopien für alle Loci getestet) im Einklang mit einer normalen oder ausgewogene Chromosomensatz für das Chromosom 5 und 9, und einen Kern mit einer abnormen Signalmuster im Einklang mit einer unsymmetrischen Produkt der Translokation das hat Monosomie (eine Kopie) für die transloziert Segment des Chromosoms 5 und Trisomie (3 Exemplare) für die transloziert Segment des Chromosoms 9. Abbildung 1 A Metaphase verbreiten und eine Interphasekern aus kultivierten Lymphozyten des peripheren Blutes von einem Träger einer reziproken Translokation zwischen dem kurzen Arm von Chromosom 5 und 9 mit Haltepunkten in 5p14.3 und 9p24.1 vorbereitet:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). FISH-Sonden wurden für beide transloziert Segmente ausgewählt (5p14.3 → 5pter, rot Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, grün Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) und der zentrischen Segment des Chromosoms 9 (9p24.1 → 9qter, blau Abbott CEP 9 alpha Satelliten SpectrumAqua). Abbildung 2. Signale in der Interphase Blastomere Kerne von Tag-3 Embryonen erfasst mit einem anderen Filter für jeden Fluorochrom und zusammengeführt, um ein zusammengesetztes Bild zu erzeugen. (A) Zwei Signale für jede Sonde zeigt zwei Kopien von jedem Ort, die im Einklang mit einem normalen oder ausgewogene Ergänzung für die Translokation Chromosomen. (B) Ein rotes Signal, drei grüne Signale und zwei blaue Signale, die eine Kopie der transloziert Segment des Chromosoms 5, drei Exemplare des transloziert Segment des Chromosoms 9 und zwei Kopien der zentrischen Segment des Chromosoms 9, die im Einklang mit benachbart ist -1 Trennung der Translokation, was zu einer unsymmetrischen Produkt mit Monosomie für 5p14.3 → 5pter und Trisomie für 9p24.1 → 9pter.

Discussion

Die Anwendung von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) zu einem einzigen Embryo Zellen (Blastomeren) stellt besondere Herausforderungen sowohl in praktischen und in der Interpretation des Signals Muster. Die Biopsie Zelle benötigt, um innerhalb einer vorher definierten Bereich auf dem Objektträger ausgestrichen werden, um seine Lokalisation folgenden FISH erleichtern; extreme Pflege braucht, um sicherzustellen, dass die Zelle lysiert ist, dass das Zytoplasma wurde verteilt eingenommen werden, und dass der Kern sichtbar ist und intakt, und wie sich die Diagnose auf die Ergebnisse dieser einzelnen Zelle, strengsten Scoring und Leitlinien für die Auslegung angewandt werden sollte, hängt. Doch in erfahrenen Händen, ist FISH eine robuste Technik für Präimplantations-Diagnostik (PGD) in der klinischen Praxis. Das Prinzip der PGD von FISH ist, dass target-spezifischen DNA-Sonden mit verschiedenen Fluorochromen oder Haptenen markierte verwendet werden, um die Kopienzahl der spezifischen Loci zu erfassen, und damit auf Chromosom Ungleichgewicht mit meiotischen Segregation der Chromosomen-Rearrangements (1) verbunden sind, einschließlich Robertson'sche erkennen Translokationen, reziproke Translokationen, Inversionen und komplexen Rearrangements (2). Fische können auch verwendet werden, um weibliche Embryonen in Familien mit X-linked Krankheit wählen, für die es keine Mutation-spezifischen Test (3, 4). Umstrittener ist FISH auch Bildschirm für sporadische Chromosom Aneuploidie benutzt worden, um zu versuchen und verbessern die Effizienz der assistierten Reproduktion (5, 6), jedoch ist der prädiktive Wert der diesen Test mit FSIH wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen ist Hände und es ist nicht für den klinischen Routineeinsatz (7) empfohlen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die technischen Aspekte und die Grenzen der FISH, die für klinische Single-Cell-Diagnose.

Methoden der Verbreitung und Befestigung einzelnen Blastomeren sind Methanol / Essigsäure (5, 8), Tween / HCl (9), und eine Kombination von Tween / HCl und Methanol / Essigsäure (10). Variationen sind hypotone Behandlung der Zellen vor der Verbreitung und / oder Pepsin und Paraformaldehyd-Behandlung nach der Fixierung. Die Methode sollte entsprechend für das Labor (14) validiert werden. Die Tween / HCl-Methode wird ausführlich in diesem Artikel beschrieben. Die Tween / HCl-Methode ist technisch einfach und hoch reproduzierbare in verschiedenen Labors. Diese Methode kann verwendet werden, um einzelne Kerne für die FISH-Diagnostik der Geschlechtsbestimmung und Chromosomenveränderungen mit akzeptablen diagnostische Genauigkeit (7) vorzubereiten.

Probe mischt kombinieren können direkt markiert und indirekt markierten Sonden und Sonden verschiedener Hersteller. Sonden für bekannte polymorphe Chromosom Regionen (11, 12), oder solche, die bekanntlich auch signifikant cross-Hybridisierung mit anderen Chromosomen (13) sollte vermieden werden, obwohl kann verwendet werden, wenn nachgewiesen werden spezifische und für PGD nach vorheriger Prüfung auf beiden reproduktiven Partner werden . Erhältlich Fluorochrome / Haptene und Strategien für anspruchsvolle Sonden gehören die folgenden: Texas Red (TR), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, biotinylierten Sonden mit TR-Avidin nachgewiesen, FITC-Avidin oder Cy-5 Streptavidin (visualisiert mit Hilfe eines FarRed Filter), eine Mischung aus Rot und Grün Sonden an ein gelbes Signal, eine zweite Runde der Hybridisierung und eine dritte Farbe, die durch sequentielle Erfassung von SpectrumOrange mit einem TexasRed und SpectrumGold Filter) erstellt produzieren.

Eine Sonde Set mit drei Sonden, die spezifisch für das Zentromer Regionen der X-und Y-Chromosomen und ein Autosom, ist für die Geschlechtsbestimmung (14) empfohlen, die autosomal-Sonde wird verwendet, um Ploidie und damit zu etablieren, um zwischen Trisomie X unterscheiden (2n, 47 , XXX) und Triploidie (3n, 69, XXX), und zwischen Tetrasomie X (48, XXXX) und Tetraploidie (4n, 92, XXXX). Ein typisches Sonde gesetzt angewendet in dieser Einstellung ist der Abbott AneuVysion Mix mit alpha-Satelliten-X, Y, und 18; dieser Sonde gesetzt wurde gezeigt, dass eine sehr niedrige Rate Polymorphismus haben und daher vor der Behandlung Aufarbeitung des reproduktiven Partner ist nicht erforderlich (14).

Die Sonde Mix für jede spezifische Umlagerung sollte: Idealerweise enthalten Sonden mindestens ausreichen, um all die erwarteten Produkte der Umlagerung mit Chromosom Ungleichgewicht zu erkennen. Wenn dies nicht möglich ist, mischt Sonde, wo die unentdeckt unsymmetrische Produkte bewertet wurden als nicht lebensfähig in einer erkennbaren Schwangerschaft und werden wahrscheinlich haben eine sehr niedrige Prävalenz akzeptabel sein kann (14). An kultivierten Lymphozyten Metaphasen sowohl reproduktive Partnern getestet werden. Mindestens zehn Metaphase Spreads sollten Sonde Spezifität, Polymorphismen und Kreuz-Hybridisierung untersucht werden, und für das Chromosom Umlagerung Träger, um sicherzustellen, dass die Sonden über die verschiedenen Segmente der Umlagerung erwartet hybridisieren. Darüber hinaus sollten mindestens 100 Interphasekernen von diesen Präparaten erzielt, um zu signalisieren Spezifität, Helligkeit und Diskretion (14) zu beurteilen.

Commercial PGS Sonde Sets sind verfügbar (zB Abbott MultiVysion PB oder PGT), Targeting die Chromosomen am häufigsten gefunden, in Produkte der Empfängnis aneuploid werden, und aus einem einzigen Sonde pro Chromosom ausgerichtet. In der Regel den Kern kann eine zweite Hybridisierung mit Sonden für zusätzliche Chromosomen Bereitstellung eines Assays für die Chromosomen 13, 15, 16, 18, 21, 22 und XY (14). Der prädiktive Wert des Tests mit der Streu-und FISH-Technik hier beschriebene ist wahrscheinlich unannehmbar niedrig bei den meisten Menschen die Hände und es ist nicht für den klinischen Routineeinsatz (7, 15) empfohlen.

Techniken wie komparative genomische Hybridisierung (CGH), die auf einzelne Zellen sind in der Lage, für die Kopienzahl von jedem Chromosom-Test (Wilton et al. 2001), und die Verwendung von Single Nucleotide Polymorphismen (SNP)-Arrays und quantitative Analyse (Wells et al . 2008) oder "karyomapping" Genotypisierung (Handyside et al. 2009) sind vielversprechende alternative Techniken auf Chromosom Aneuploidie zu erkennen. Allerdings bleiben die Auflösungsgrenze und Genauigkeit für das Segment Ungleichgewicht unsicher und es ist wahrscheinlich, dass FISH wird weiterhin die Methode der Wahl für Chromosomenveränderungen mit kleinen Segmenten werden.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Hydrochloric Acid, 2.5L		VWR	101254H
Sodium Chloride, 5Kg		VWR	443827W
Potassium Chloride, 250g		VWR	26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g		VWR	102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g		VWR	10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g		VWR	28245.265
Tween20, 500mL		VWR	663684B
Ethanol, 2.5L		VWR	8.18760.2500	Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg		VWR	27833.363
Cow Gum, 250mL		Cow Proofings Ltd.	No longer available	Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul		Cytocell	DES500L	150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL		Boots	10088316001
Amine-coated Slides, 25		Genetix	K2615
DAPI, 0.1mL		Sigma-Aldrich	D-9542
Vectashield, 10mL		Vector Laboratories	H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2016
FITC-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL		GE Healthcare	PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500		Thistle Scientific	AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000		Thistle Scientific	AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400		Sterilin	128B	Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick		VWR VWR VWR	451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes		Fisher Scientific	PMK-300-052R
Dissecting Microscope		Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes		NHS SUPPLY CHAIN	MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays		VWR	682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece		Scientific Laboratory Supplies	HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter		Fisher Scientific	FDM-340-010U
Diamond Pen		VWR	818-0021
Hot Block for Slides		Thermo Hybaid	HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll		NHS SUPPLY CHAIN	MJT004
Schieferdecker Jar		VWR	631-9313
Coplin Jar		VWR	631-9331
Forceps, Fine		VWR	232-2123
Forceps, Blunt		VWR	232-2113
1000mL Beaker		VWR	213-1642
Phase Contrast Microscope		Nikon	E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100		Fisher Scientific (Raymond Lamb)	SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3206
1mL Syringe, box of 100		NHS Supply Chain	FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000		Thistle Scientific	AX-T-1000-C-L-R
Incubator		LEEC
Waterbath		Grant	W22
Alcohol Thermometer				Various sources available
pH Meter		Jenway	3305
pH Electrode		VWR	662-1759	BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer		Bibby	HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500		Scientific Laboratory Supplies	PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m		VWR	291-1214