Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.
Pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) is een gevestigde alternatief voor prenatale diagnose, en het gaat om het selecteren van pre-implantatie embryo's van een cohort gegenereerd door geassisteerde reproductie technologie (ART). Deze selectie kan nodig zijn omdat de familiale monogene ziekte (bijvoorbeeld cystic fibrosis), of omdat een partner draagt een chromosoom herschikking (bijvoorbeeld een twee-weg wederzijdse translocatie). PGD is beschikbaar voor koppels die hebben gehad vorige getroffen kinderen, en / of in het geval van chromosoom herschikkingen, terugkerende miskramen of onvruchtbaarheid. Eicellen geaspireerd na ovariële stimulatie worden bevrucht door in vitro onderdompeling in sperma (IVF) of intracytoplasmatische injectie van door een individuele zaadcel (ICSI). Pre-implantatie decollete-stadium embryo's worden gebiopteerd, meestal door het verwijderen van een enkele cel op dag 3 na de bevruchting, en de biopsie cel is getest op de genetische status van het embryo vast te stellen. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op het vaste kernen van biopsie cellen met target-specifieke DNA-probes is de techniek bij uitstek om chromosoom onbalans geassocieerd met chromosoom herschikkingen te sporen, en aan vrouwelijke embryo's in gezinnen te selecteren met de X-gebonden aandoening waarvoor geen mutatie-specifieke test. FISH is ook gebruikt om te screenen van embryo's voor spontane chromosoom aneuploïdie (ook bekend als PGS of PGD-AS) om te proberen en het verbeteren van de efficiëntie van de geassisteerde voortplanting, maar de voorspellende waarde van deze test met de verspreiding en FISH techniek hier beschreven waarschijnlijk onaanvaardbaar laag zijn in de meeste mensen de handen en het wordt niet aanbevolen voor routine klinisch gebruik. We beschrijven de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op PGD in een klinische setting.
De toepassing van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) tot een enkele embryo cel (blastomeer) presenteert speciale uitdagingen, zowel in praktische en in de vertolking van het signaal patroon. De gebiopteerd cel dienen te worden gemaakt binnen een vooraf bepaald gebied op de dia om zijn lokalisatie volgende vissen te vergemakkelijken; uiterste zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de cel is gelyseerd, dat het cytoplasma is verspreid, en dat de kern is zichtbaar en intact, en, als de diagnose is afhankelijk van de resultaten van deze enkele cel, strenge scoring en interpretatie richtlijnen moeten worden toegepast. Echter, in ervaren handen, FISH is een robuuste techniek voor pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in de klinische praktijk. Het principe van PGD door FISH is die zich richten op specifieke DNA-probes gelabeld met verschillende fluorochromen of haptenen kan worden gebruikt om het aantal kopieën van specifieke loci detecteren, en daarmee op te sporen chromosoom onbalans in verband met de meiose scheiding van chromosoom herschikkingen (1), inclusief Robertsoniaanse translocaties, wederzijdse translocaties, inversies, en complexe herschikkingen (2). FISH kan ook worden gebruikt om de vrouwelijke embryo's in gezinnen te selecteren met de X-gebonden aandoening, waarvoor er geen mutatie-specifieke test (3, 4). Meer controversieel is FISH ook gebruikt om te screenen op sporadische chromosoom aneuploidie om te proberen en het verbeteren van de efficiëntie van geassisteerde reproductie (5, 6), maar de voorspellende waarde van deze test gebruik van FSIH waarschijnlijk onaanvaardbaar laag in de meeste mensen handen en het wordt niet aanbevolen voor routine klinisch gebruik (7). Dit artikel concentreert zich op de technische aspecten en de beperkingen van de FISH toegepast op klinische eencellige diagnose.
Methoden van verspreiding en de vaststelling single blastomeren omvatten methanol / azijnzuur (5, 8), Tween / HCl (9), en een combinatie van Tween / HCl en methanol / azijnzuur (10). Variaties zijn hypotone behandeling van cellen voorafgaand aan de verspreiding en / of pepsine en paraformaldehyde behandeling na fixatie. De methode moet op passende wijze worden gevalideerd voor het laboratorium (14). De Tween / HCl methode wordt in detail beschreven in dit artikel. De Tween / HCl methode is technisch eenvoudig en zeer reproduceerbaar in verschillende laboratoria. Deze methode kan gebruikt worden om enkele kernen voor te bereiden op de FISH diagnose van geslachtsbepaling en chromosoom herschikkingen met aanvaardbare diagnostische nauwkeurigheid (7).
Probe mixen kunt combineren direct gelabeld en indirect gelabelde probes, en probes van verschillende fabrikanten. Probes voor bekende polymorfe chromosoom regio's (11, 12), of die waarvan bekend is dat cross-hybridiseren met andere chromosomen (13) moet worden vermeden, maar kan worden gebruikt als aangetoond dat specifieke en geschikt te zijn voor PGD vooraf testen op zowel de reproductieve partners . Beschikbaar fluorochromen / haptenen en strategieën voor de veeleisende probes omvatten het volgende: Texas Red (TR), fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, gebiotinyleerd sondes gedetecteerd met TR-avidine, FITC-avidine, of Cy-5 streptavidine (gevisualiseerd met behulp van een FarRed filter), een mix van rood en groen sondes naar een geel signaal, een tweede ronde van hybridisatie en een derde kleur gemaakt door opeenvolgende vastleggen van SpectrumOrange met behulp van een TexasRed en een SpectrumGold filter) te produceren.
Een sonde set met drie probes, specifiek voor de centromeer regio's van de X-en Y-chromosomen en een autosoom, wordt aanbevolen voor geslachtsbepaling (14); de autosomaal sonde wordt gebruikt voor het ploïdie en daarmee vast te stellen onderscheid te maken tussen trisomie X (2n, 47 , XXX) en triploïdie (3n, 69, XXX), en tussen tetrasomy X (48, XXXX) en tetraploidy (4n, 92, XXXX). Een typische probe set toegepast bij deze instelling is de Abbott AneuVysion mix die alfa-satelliet X, Y, en 18, dit probe set is aangetoond een zeer laag tarief polymorfisme hebben, en dus voorbehandeling work-up van de reproductieve partners is niet vereist (14).
De probe mix voor een specifieke omlegging moet: het ideale geval bevatten probes ten minste voldoende zijn om alle verwachte producten van de omlegging met chromosoom onbalans op te sporen. Indien dit niet mogelijk is, sonde mixen waar het onopgemerkt onevenwichtige producten zijn beoordeeld aan niet-levensvatbaar zijn in een herkenbare zwangerschap en hebben waarschijnlijk een zeer lage prevalentie aanvaardbaar kan zijn (14). Worden getest op gekweekte lymfocyten metafasen van beide reproductieve partners. Minstens tien metafase verspreidt moet worden onderzocht voor de sonde specificiteit, polymorfismen en cross-hybridisatie, en, voor de omlegging chromosoom drager, om ervoor te zorgen dat de sondes zoals verwacht op de verschillende segmenten van de herschikking hybridiseren. Daarnaast moet ten minste 100 interfase kernen van deze voorbereidingen worden gescoord om aan te geven specificiteit, de helderheid en discretie (14) te beoordelen.
Commercial PGS probe sets zijn beschikbaar (bijv. Abbott MultiVysion PB of PGT), gericht op de chromosomen meest voorkomende te zijn aneuploïde in producten van de bevruchting, bestaande uit een sonde per chromosoom gericht. Typisch de kern kan een tweede hybridisatie met probes voor extra chromosomen die een test voor chromosomen 13, 15, 16, 18, 21, 22 en XY (14). De voorspellende waarde van deze test met de verspreiding en FISH techniek hier beschreven is het waarschijnlijk onaanvaardbaar laag zijn in de meeste mensen de handen en het wordt niet aanbevolen voor routine klinisch gebruik (7, 15).
Technieken zoals vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) toegepast op enkele cellen zijn in staat om te testen voor het aantal kopieën van elk chromosoom (Wilton et al.. 2001), en het gebruik van single nucleotide polymorfismen (SNP) arrays en kwantitatieve analyse (Wells et al. . 2008) of "karyomapping" genotypering (Handyside et al.. 2009) zijn veelbelovende alternatieve technieken op chromosoom aneuploidie te detecteren. Echter, de resolutie te beperken en nauwkeurigheid voor het segment onbalans blijft onzeker en het is waarschijnlijk dat FISH zal blijven om de techniek van de keuze voor chromosoom herschikkingen met kleine segmenten.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Hydrochloric Acid, 2.5L | VWR | 101254H | ||
Sodium Chloride, 5Kg | VWR | 443827W | ||
Potassium Chloride, 250g | VWR | 26764.232 | ||
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g | VWR | 102494C | ||
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g | VWR | 10203 4B | ||
Sodium Hydroxide Pellets, 500g | VWR | 28245.265 | ||
Tween20, 500mL | VWR | 663684B | ||
Ethanol, 2.5L | VWR | 8.18760.2500 | Duty Paid | |
Tri-Sodium Citrate, 5Kg | VWR | 27833.363 | ||
Cow Gum, 250mL | Cow Proofings Ltd. | No longer available | Old stocks can still be found in art shops | |
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul | Cytocell | DES500L | 150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe | |
Nail Varnish, 12mL | Boots | 10088316001 | ||
Amine-coated Slides, 25 | Genetix | K2615 | ||
DAPI, 0.1mL | Sigma-Aldrich | D-9542 | ||
Vectashield, 10mL | Vector Laboratories | H1000 | ||
Texas-Red-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2016 | ||
FITC-avidin, 0.001mL | Vector Laboratories | A-2011 | ||
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL | GE Healthcare | PA45001 | ||
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500 | Thistle Scientific | AX-MCT-175-C | ||
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000 | Thistle Scientific | AX-MCT-060-C-CS | ||
30ml Universal Containers, box of 400 | Sterilin | 128B | Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053 | |
Hot Block | ||||
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick |
VWR VWR VWR |
451-0107 451-3112 451-3111 |
||
Plugged Glass Pipettes | Fisher Scientific | PMK-300-052R | ||
Dissecting Microscope | Wild Heerbrugg | |||
Tissues, 100boxes | NHS SUPPLY CHAIN | MJT058 | ||
Metal Culture Trays | ||||
Plastic Melamine Trays | VWR | 682-009 | ||
Oven | ||||
Mouth Pipette Mouthpiece | Scientific Laboratory Supplies | HAE3700 | ||
Tubing | ||||
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter | Fisher Scientific | FDM-340-010U | ||
Diamond Pen | VWR | 818-0021 | ||
Hot Block for Slides | Thermo Hybaid | HBOSBB | ||
Hybridization Chamber | ||||
Tissue Roll | NHS SUPPLY CHAIN | MJT004 | ||
Schieferdecker Jar | VWR | 631-9313 | ||
Coplin Jar | VWR | 631-9331 | ||
Forceps, Fine | VWR | 232-2123 | ||
Forceps, Blunt | VWR | 232-2113 | ||
1000mL Beaker | VWR | 213-1642 | ||
Phase Contrast Microscope | Nikon | E200 | ||
Fibre-free Blotting Cards, box of 100 | Fisher Scientific (Raymond Lamb) | SDE1 | ||
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3022 | ||
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3110 | ||
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3104 | ||
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100 | Scientific Laboratory Supplies | MIC3206 | ||
1mL Syringe, box of 100 | NHS Supply Chain | FWC045 | ||
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000 | Thistle Scientific | AX-T-1000-C-L-R | ||
Incubator | LEEC | |||
Waterbath | Grant | W22 | ||
Alcohol Thermometer | Various sources available | |||
pH Meter | Jenway | 3305 | ||
pH Electrode | VWR | 662-1759 | BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305 | |
Heated Stirrer | Bibby | HC502 | ||
1mL Pasteur Pipettes, box of 500 | Scientific Laboratory Supplies | PIP4202 | ||
Parafilm, 50mm x 75m | VWR | 291-1214 |