קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

Summary

מניפולציות גנטיות רבות ו / או זריקות intramyocardial של גנים, חלבונים, תאים, ו / או biomaterials באים על גבי מימד הזמן במחקרים של פגיעה איסכמיה / reperfusion חריפה שיפוץ כרונית בעכברים. וידאו זה ממחיש את הליכי microsurgical עבור איסכמיה / reperfusion, קשירת עורק כלילי קבע, ומחקרים הזרקת intramyocardial.

Abstract

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.

Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.

Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.

Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Protocol

מכשירי ניתוח סטרילי (טבלה 1) ו – 3 "applicators כותנה היטה ממוקמות על underpad סטרילית. מעקר חרוז (Germinator 500) מופעלת. עכברים (גיל:> 6 שבועות; wt:> 18g) מורדמים עם זריקה ip של 20μl / g BW של tribromoethanol (250mg/kg, משך כ – 40 דקות). כאשר העכברים אינם מגיבים לצבוט-הבוהן, חומר סיכה סטרילי (דמעות מחודשת) על העיניים כדי להגן עליהם מפני יובש וגם את הצד השמאלי של החזה מצופה מקריח (למשל Nair) כדי להסיר את הפרווה מן העור. מקריח הוא נשטף עם מים זורמים חמים בבטאדין / אלכוהול בניקוי משמש כדי לחטא את אזור הניתוח. העכבר מונח על משטח חם מקורר באופן איזוטרמי deltaphase אשר קבוע לטבלה פרספקס. כל איבר משותק באמצעות קלטת חוט עבה ממוקם בצורה אופקית מתחת לשיניים העליונות להחזיק את הלסת העליונה במקום. הטבלה במאונך אור סיב אופטי הוא זרח ישירות על גבי באזור הצוואר לתאורה הושט. זה דורש המיקום המדויק כזה הפתיחה של הגרון נתפסת פתח מואר היטב, ובכך לאפשר קנה הנשימה כדי להיות דמיינו כדי להקל על החדרת צינורות PE. צינורות מחוברת למכונת הנשמה לאחר מכן (מחוברת של 95% O 2 / 5% CO 2) לנהל את לחץ מתמיד אוורור חיובי (Topo ההנשמה; שיעור 125 נשימות / דקה; שיא inspiratory 10-12 לחץ CMH 2 O; לב * : הגדרות להשתנות עם זן ומין 1-3). לאחר אוורור הוא אושר על ידי תנועות החזה סינכרוני, החיבור הוא קבוע כרית עם קלטת כדי למנוע האקסטובציה במהלך הניתוח. בעזרת מלקחיים שיניים למשוך העור למעלה מן החזה, להב אזמל סטרילי # 10 מחוברת ידית # 3 האזמל משמש לביצוע חתך 1.5cm במקביל את העור עצם החזה. Curved microscissors Vanna משמשים לחתוך את השרירים הפקטוראלי ולעשות חור קטן בשריר צלעי. סטרייט, microscissors בוטה משמשים לחתוך 3 צלעות. ספקולום 9mm עיניים ילדים משמש לחזור בו כלוב הצלעות. באמצעות מלקחיים מעוקל, למשוך את קרום הלב מן הלב להשתמש במלקחיים שיניים בעדינות כדי לקרוע אותו פתוח. באמצעות בעל מחט Castroviejo, נקודת קוני 6 מ"מ 3 / 8 האשכולות המחט תפר 8-0 פוליאתילן מתחת הקדמי השמאלי היורד לב כלילית (לאורך ציר זמן של הלב) בניצב אליו. עבור ליגטורה זמני כי ניתן להסיר את reperfusion מתוזמן, פיסת סטרילי 0.5-1cm של PE90 מושם על הלב במקביל העורק הכלילי. תפר, שבה יש היכרות קודמת כרך תחת העורק הכלילי, קשורה מכן בצינור. באותו זמן היא להשתחרר, ליגטורה הוא רופף. זה יכול להיות חזר כרצונכם ואת הזמן של חסימה / reocclusion יכול להיות שונה 4. בהתאם לאורך הפרוטוקול ואת סוג של הרדמה המשמשים, תוספי עשוי להיות נחוץ. לגבי חסימה קבועה, המיתר שילב תחת העורק הכלילי הוא קשור פשוט. לחלוט dyskinesia ניכרים ואת הקצה הארוך של תפר הוא חתך 5-10. עבור זריקה intramyocardial (ים), מזרק סטרילי המילטון עם מחט סטרילית 30 מד משופעים מוחדר בבסיס הלב מעל אזור הפגיעה בצד ימין של המיתר. המחט היא מתקדמת אז לאזור הפציעה ומסוגר מעט כך שפוע ניתן לראות כ בבית באזור הגבול. חלק מהפתרון של המזרק (2-3μl) מוזרק לתוך הלב מחט מוחזק במקום. מזרק היא נסוגה עוד 1-3mm ושאר הפתרון הוא מוזרק. מזרק נערכת במקום עד בועה כי הוא נוצר על ידי הפתרון מתפוגג. המחט מוסרת אז. אם יש דימום כלשהו, ​​המוליך כותנה שקצהו נלחץ בעדינות על גבי אתר הכניסה מחט עד שהדימום ייפסק 5-7. לאחר מניפולציות שריר הלב הושלמו, retractors הצלעות יוסרו את חלל בית החזה סגור עם 2-3 תפרים מזרן באמצעות 6-0 תפר surgipro. שתיים ושלוש התפרים המזרן עשויים אז כדי לסגור את השרירים הפקטוראלי, 1-3 טיפות של 1:10 marcaine 0.25% בשנת מלוחים סטרילית (עכבר 0.1ml/25g) על השריר ואז 2-3 תפרים מזרן נעשים לסגור את העור. העכבר הוא להסיר את מכונת ההנשמה. הנשימות הקצובות פעם, מהירה, רדודה מאומת, העכבר יכול להיות extubated. 0.5ml מלוחים חמים סטרילי מוזרק אל תוך החלל התת עורית הגב ואת העכבר מונח על כרית חימום בכלוב עד שהוא חוזר הניידות (1 מינימום שעה). על הניסויים הישרדות, עכברים ממוקמים בחזרה לתוך כלובים וחזרו ביבר עד הזמן של הקרבה. 2 במהלך הימים הראשונים, לחלח המזוןשהונחו על רצפת הכלוב, כדי להקל על האכלה (ולכן הם לא חייבים להגיע עד אשר עלולים לגרום כאב) ואת עצירות צריכה להינתן כל 6-12hr. הטיפול שלאחר הניתוח כולל גם ניטור יומיומי בשבוע הראשון כדי לוודא ניידות נאותה, טיפוח, והרגלי אכילה. המכשירים הם כירורגית נמחק עם אתנול ונוסף מעקר את החרוז לפני הניתוח הבא. בזמנו של הקרבה, עכברים מורדמים עם נתרן pentobarbital (65mg/ml: 55-65 מ"ג / ק"ג). כאשר מטוס נאותה הרדמה מושגת, חלל בית החזה נפתח. בעוד הלב עדיין פועם, מזרק עם מחט 23 מד המכיל אשלגן כלורי קר (KCl, 30mm) או 2,3-butanedione monoxime (^ נם; 10mm) משמש כדי לנקב את אזור הבסיס האחורי של החדר ואת הפתרון מוזרק באיטיות אל תוך החדר עד הלב הוא נעצר תרויח. לאחר לב מוסר, מזרק המכיל PBS משמש retrogradely perfuse לשטוף את הלב כדי להסיר כל הדם שנשאר. עבור מחקרים חריפה, בסוף התקופה reperfusion, הנער מחדש ligated בנקודה המקורית של חסימה. פתרון המכיל כחול 1% של אוון מוזרק לתוך האאורטה. לאחר לב מופק, הוא חתך רוחבי לתוך 3 חלקים של עובי שווה, מודגרות ב -1% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד, הדמיה עבור ניתוחים morphometric 11. עבור מחקרים כרונית, הלב הוא שקוע אז מקבע, מעובד אז מוטבע על פי נהלים שגרתיים. שקופיות אז יכול להיות מוכתם בהיסטולוגיה הדמיה עבור ניתוחים morphometric (באמצעות Scion, NIH תמונה J, או Image Pro Plus) 9,10,12. נציג תוצאות: כאשר נעשה בצורה נכונה, שיעורי ההישרדות של עכברים (זכרים: גיל 8-10 שבועות, 22-28g, נקבה: גיל 10-12 שבועות, 20-26g) הם: מעל 90% ב איסכמיה חריפה / reperfusion וניסויים נפשית מראש איסכמי, על 85% במחקרים קשירת עורק קבוע, וכ -80% עבור זריקות intramyocardial. מאז הפציעה מוקדם יותר בקלות גלוי על ידי שינויים מטבוליים מאשר קביעה המבנית, גודל האוטם ב איסכמיה / reperfusion וניסויים נפשית מראש איסכמי מבוצע על ידי החדרת צבע 1% של אוון כחול אל אבי העורקים אשר perfuse הלב שאינו מסופק על ידי הנער ( איור 1 א). פעם מסירים את הלב וחותכים רוחבי במחצית, הרקמה מודגרות בתמיסה של 1% כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium למדידת גודל האוטם (איור 1B). האזורים נמדדים באמצעות Scion או NIH תוכנת הדמיה אשר יכולים להיות מכויל באמצעות מיקרומטר הדמיה בהגדלה זהה. מספרים אלה משמשים לחישוב שטח בסיכון / האוטם החדר השמאלי גודל / שטח בסיכון 11. ההבדלים מסננים יכול לגרום לשינויים במשקל הגוף ואת גודל הלב ולכן יש להיזהר לנרמל אמצעים אלה משקל לב, משקל גוף, או אורך השוקה לצורך השוואתי. קבע קשירת העורק גורמת לשינויים מבניים ברוטו כגון נמק, קיר דליל, והתרחבות קאמרית. השוואה של השפעות של טיפול ו / או זמן על גודל האוטם ו נמק יחסית החדר השמאלי, באזור תא, קיר במחיצה בין החדר השמאלי ואת חינם עובי דופן במודל חסימה קבועה (איור 2 א) ניתן גם למדוד באמצעות Scion או NIH הדמיה התוכנה. מכתים קולגן עם ירוק picrosirius אדום / מהיר (תרשים 2B) ניתן להשתמש כדי למדוד סיסטיק insterstitial אשר וקושרת את המדדים תפקודית של 8-10 קיר התקשות. התמונה באיור 3 מייצג את ההפצה של פתרון 6ul (כחול של אוון) המוזרק לאזור הגבול של הלב בעקבות קשירת עורק קבע. שימו לב כי זה ממשיך בכיוון של הפגיעה, כמו גם לעבר בסיס וגם transmurally. באיור 1. א 'אוון' s כחול מוזרק האאורטה לפני כריתה. תמונה זו מראה את האזורים perfused של הלב (מוכתמים) ואזור occluded (בלא כתם). אוון ב 's כחול מכתים TTC בעקבות פציעה איסכמיה / reperfusion חריפה. זוהי תמונה מייצגת (20x) מראה את התפלגות צבע כחול אשר מוכתם האזורים unoccluded וכן מכתים TTC של רקמת קיימא מבחינה מטבולית (אדום). אזורים נקרוטי לא ללכלך ולכן הם נשארים חיוורים (המפורטים). איור 2. א Hematoxylin ו eosin הכתם. זוהי תמונה מייצגת (20x) של H & E מכתים לב העכבר לחתוך רוחבי ב 4 ימים דרך באזור האוטם לאחר MI (20x). * מציין נמק רקמות, החצים מצביעים על רקמת פרור, RV = זכות החדר ואת LV = החדר השמאלי. B. Picrosirius אדום וירוק מהיר הכתם. זהונציג תמונה (20x) של picrosirius אדום / ירוק מכתים מהיר של חתך של הלב העכבר 4 שבועות לאחר אוטם לבבי. הכתמים הציטופלסמה ירוק סיבי קולגן אדומות. איור 3. ההפצה כתם כחול אוואן לצבוע הבאים הזרקה intramyocardial 6ul. זוהי תמונת מראה נציג ההפצה הגלובלית transmural של צבע כחול של אוון בכל לב את הדברים הבאים הזרקה intramyocardial 6ul על אזור הגבול מיד לאחר קשירת עורקים כליליים (12x).

Discussion

מחלת לב כלילית ממשיך להיות בריאות epidemiologically ו כספית משמעותית בעיה ציבורית. מחקר בסיסי ניכרת עדיין יש צורך להבין את המנגנונים שבאמצעותם פציעה שיפוץ להתקדם ואיך הרפוי פוטנציאליים עשויה לווסת את התהליכים האלה, אם הם להיות מפותחים לשימוש קליני. המכרסמים הנפוץ ביותר ואת מגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטית זמין עושה את זה מין מודל אטרקטיבי יותר.

אמנם יש הבדלים בין עכברים מינים אחרים, יש יתרונות רבים למודל Murine. שימוש בהיקף לנתח פשוט או זכוכית מגדלת ותנאי מואר היטב כדי לאפשר את vasculature בקלות לראות (ברוטו עבור האנטומיה מפורט של כלי הדם, ראה Salto-Tellez et al. 2004, ^13). כדי להפחית את הסיכון לתמותה לאחר הניתוח, חשוב מאוד כדי למנוע ניתוק כלי גדול מאז נפח הדם הכולל של עכבר 25 גרם פחות מ 2ml ^14. במקרה של דימום יתר מתרחשת, יישום עדין של לחץ או צריבה לאתר ניתן להשתמש כדי לעצור את הדימום.

הליך זה יכול להיות גם שינוי במגוון של דרכים. למשל, בעכברים ניתן בהרדמה באמצעות isoflurane, קטמין / xylazine, או נתרן pentobarbital ובחירת המתאימה נקבעת על פי משך הזמן של פרוטוקול ^15-18. רפלקס הבוהן קמצוץ הוא המדד הנפוץ ביותר של עומק ההרדמה. יתר על כן, כדי לשפר את הסיכוי להישרדות ארוכת טווח, חוקרים אחדים להשתמש בסמים antiarrhythmic כגון לידוקאין כדי להפחית את השכיחות של הפרעות קצב קטלניות ^19,20 עם זאת, יש לקחת בחשבון כי זה לאחרונה הראו תכונות antiapoptotic ב חריפה מודל ^21. כמו כן, כדי להפחית את הכאב שלאחר הניתוח, משככי כאבים כגון עצירות יכולה להינתן במשך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח ^{3,16,17,22,23.} כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן ניתוח (בעיקר בפרוטוקולים יותר), בדיקה רקטלית בסדרה עם כרית חימום משמש לעתים קרובות במקום כרית מקורר באופן איזוטרמי. עבור איסכמיה / reperfusion ו / או איסכמי מראש או postconditioning: את משך הזמן של חסימה (ים) ו reperfusion (ים) ניתן לשנות, כי חסימה קבועה, בגודל של האוטם עשוי להיות שונה על ידי התאמת המיקום של המיתר; עבור זריקות intramyocardial (תאים למשל, חלבונים), לא יכולה להיות במקומות 1-3 הזרקת ונפח לכל זריקה יכול להיות עד 15 ²⁴ μl. אם התאים להיות מוזרק, מד המחט בשימוש (בדרך כלל 26-30) ^5,25,26 יש לבחור בהתבסס על גודל התאים כך את הקוטר הפנימי של המחט הוא גדול מספיק כדי למנוע את הסתייגותו. כדי למנוע בלבול עקב תהליכים דלקתיים מופעלות על ידי הניתוח, חוקרים אחדים דיווחו על שימוש מוקש כי היא מניפולציה vivo לשעבר כדי לחסום את ליבם ואת reperfuse בעכבר החזה סגור בשלב כלשהו לאחר הניתוח ^27-29. לאחרונה, גאו et al. ³⁰ הראו כי חסימה זמניים וקבועים יכול להתבצע ללא צורך אוורור במעבדות ספורות החלו להשתמש אולטרסאונד כדי לבצע סגור החזה intramyocardial זריקות ^25,31.

מאז המחקר הראשון הוכחת ההיתכנות של ligating לב כלילית אצל עכברים פורסם על ידי ג 'ונס ו אולסון בשנת 1954 ^32, ורבים אחרים אימצו את מודל שונה הוא ללמוד היבטים שונים של פגיעה בשריר הלב שיפוץ ^3,33-45. טבעו של עכברים מבחינת גודל, יכולת הרבייה, והוצאות יחסית פחות לרכישה ותחזוקה להפוך את זה למין כלי מושך עבור מגוון רחב של מחקרים פיזיולוגי pathophysiologic. ככל המזעור של הטכנולוגיה עבור הדמיה ההתקדמות vivo ^46-49, כמו גם האמצעים לבצע ולנתח הגנומיקה בקנה מידה גדול proteomics, הקרנת סמים, היעילות של טיפולים מבוססי תאים ו / או חלבון, כמו גם biomaterials ^50-64, בשילוב עם מגוון רחב יותר ויותר של מניפולציות גנטיות המוענקת על ידי רקמה או בכל מקום העכברים הטרנסגניים או מוטציה / בנוקאאוט ספציפי, המודל Murine של אוטם שריר הלב ללא ספק להמשיך להיות כלי רב ערך בהערכת פגיעה לבבית חריפה שיפוץ לטווח ארוך. לכן, יש ערך מוטלת בספק להיות מסוגל לבצע ניסויים אלו אמין reproducibly.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Long Vanna Scissors		George Tiemann	160-159
Micro Dissecting Scissors		George Tiemann	160-161
Forceps – straight, 1×2 teeth		George Tiemann	105-205
Scalpel handle #3		George Tiemann	105-64	#10 sterile blade
Forceps – half curved serrated		George Tiemann	160-19
Tissue Scissors		George Tiemann	105-410
Castroviejo Needle Holder		Miltex	18-1828
Cook Eye Speculum		Miltex	18-63
Surgipro II 8-0		Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0		Suture Express	8776
Germinator 500 Bead Sterilizer		Cellpoint Scientific	65369-1
Deltaphase isothermal pad		Braintree Scientific	39DP
Hamilton syringe – 25μl		Hamilton	80430
30 gauge beveled needle		Hamilton	7803-07
Ventilator		Kent Scientific	TOPO